62. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

Genehmigungsinhaber(in)

Evotec AG, Hamburg

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)

Im Rahmen der Erweiterungen der Genehmigung vom 18.04.2011, 04.06.2013 und 18.02.2016 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linien genehmigt:

• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• RUES2 (The Rockefeller University, New York, NY, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Aufklärung zellulärer und molekularer Prozesse, die an der Pathogenese der Huntingtonschen Krankheit (Chorea Huntington) beteiligt sind sowie die Identifizierung von (niedermolekularen) Substanzen, die die phänotypische Ausprägung der Merkmale des Chorea Huntington auf zellulärer Ebene beeinflussen können. Zu diesem Zweck soll aus hES-Zellen jener Typ neuraler Zellen gewonnen werden, in dem der mit der Huntingtonschen Krankheit verbundene zelluläre Phänotyp am stärksten ausgeprägt ist (sog. Medium-Spiny-Neuronen, MSN). Die Differenzierungseffizienz in diesen Typ neuronaler Zellen soll insbesondere durch den Einsatz sog. kleiner Moleküle erhöht werden, die ggf. im Rahmen eines Screenings von bei der Genehmigungsinhaberin vorhandenen Bibliotheken entsprechender Substanzen im Hochdurchsatzverfahren bezüglich ihrer Wirkung auf hES-Zellen getestet werden sollen. Die differenzierten MSN sollen umfassend in vitro charakterisiert werden, insbesondere hinsichtlich ihres Transkriptoms sowie ihrer immunzytochemischen Eigenschaften. Danach soll durch Transfer des Gens für mutiertes Huntingtin (mHtt) in aus hES-Zellen differenzierte neurale Vorläuferzellen und anschließende Differenzierung der so genetisch veränderten Zellen zu MSN ein Zellmodell für Chorea Huntington etabliert werden, an dem verschiedene Aspekte dieser Krankheit untersucht werden sollen. In proof of concept-Experimenten soll zunächst überprüft werden, ob die so gewonnenen Zellen einen für Chorea Huntington typischen Phänotyp aufweisen, wie beispielsweise eine Aktivierung von Caspasen, die verminderte Präsenz von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren, eine verminderte Histondeazetylase-Aktivität und eine veränderte metabolische Funktion der Mitochondrien. Anschließend soll dieses Zellmodell zur Etablierung von Hochdurchsatzverfahren verwendet werden, mit deren Hilfe niedermolekulare Substanzen identifiziert werden sollen, die spezifische phänotypische Ausprägungen des Chorea Huntington auf zellulärer Ebene positiv beeinflussen können..

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Die im Forschungsvorhaben geplante Entwicklung und Optimierung von Protokollen für die Differenzierung von hES-Zellen zu MSN soll zum Verständnis der entsprechenden Differenzierungsprozesse beitragen. Durch die Bestimmung der Wirkungen niedermolekularer Substanzen auf sich in MSN differenzierende hES-Zellen sollen Rückschlüsse auf Moleküle und Signalwege gezogen werden, die an diesen Differenzierungsprozessen beteiligt sind. Daraus ließen sich im Ergebnis nicht nur optimierte Protokolle für die In-vitro-Differenzierung in diese Zellen ableiten, sondern ggf. auch Rückschlüsse auf Vorgänge bei der Entstehung solcher Neuronen während der Embryonalentwicklung des Menschen ziehen.

Ferner ist geplant, auf der Grundlage der aus hES-Zellen hergestellten MSN ein zelluläres Modell für den Chorea Huntington zu etablieren, indem mHtt-Gene in diesen Zellen zur Expression gebracht werden. Durch vergleichende Analysen des Phänotyps dieser Zellen mit jenem von aus genetisch unveränderten hES-Zellen hergestellten MSN soll geklärt werden, ob und inwieweit ein solches Zellmodell molekulare und zellbiologische Eigenschaften der von der Huntingtonschen Krankheit betroffenen Neuronen spiegeln kann und zur Untersuchung von bestimmten Aspekten der Huntingtonschen Krankheit geeignet ist. Die geplanten Analysen sollen beispielsweise neue Erkenntnisse darüber erbringen, welche Veränderungen die Expression von mHtt-Genen in humanen MSN bezüglich des Transkriptoms und der Rezeptorausstattung der Zellen, hinsichtlich apoptotischer Prozesse oder im Hinblick auf ultrastrukturelle Veränderungen und die metabolische Aktivität der Mitochondrien bewirkt. Dies kann im Ergebnis zu einem vertieften Verständnis jener zell- und molekularbiologischen Prozesse führen, die an der Pathogenese des Chorea Huntington beteiligt sind.

Nach erfolgreicher Etablierung des Zellmodells soll untersucht werden, ob die Behandlung der Zellen mit niedermolekularen Substanzen Auswirkungen auf den Grad der Ausprägung des für mHtt-Neuronen typischen Phänotyps haben. Dabei steht die Frage im Vordergrund, ob bestimmte Eigenschaften dieser Zellen durch niedermolekulare Substanzen in Richtung eines wt-Phänotyps verändert werden können. Dies soll zunächst mit in ihrer Wirkung auf die Huntingtonsche Krankheit bekannten Substanzen erprobt und der Ansatz anschließend auf umfangreiche Bibliotheken niedermolekularer Substanzen im Hochdurchsatzverfahren ausgedehnt werden. Durch die Identifizierung von Substanzen mit Wirkung auf mHtt-Neuronen und die anschließende Charakterisierung ihres Wirkmechanismus lassen sich voraussichtlich Rückschlüsse auf Moleküle und Signalwege ziehen, die an der Ausprägung jener Eigenschaften beteiligt sind, die für die von der Huntingtonschen Krankheit betroffenen Neuronen typisch sind. Gegebenenfalls können als hier wirksam identifizierte Substanzen auch die Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung des Chorea Huntington bilden.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Die Protokolle für die Differenzierung von murinen ES-Zellen in GABAerge Neurone des Striatums sind in der Literatur beschrieben. Die geplante Vorgehensweise zur Differenzierung humaner ES-Zellen in MSN basiert zudem auf einem Protokoll, das in der Vergangenheit bereits an hES-Zellen etabliert und publiziert worden ist und im beantragten Vorhaben optimiert werden soll. Die potentiellen Wirkungen niedermolekularer Substanzen auf grundlegende Eigenschaften embryonaler Stammzellen, wie beispielsweise Selbsterneuerung und Differenzierung, sind aus der Literatur ebenfalls bekannt.

Die Fragestellungen zu den maßgeblichen Charakteristika der von Chorea Huntington betroffenen Neuronen zielen auf die Analyse aus der Literatur bekannter Eigenschaften von mHtt-Neuronen. Diese wurden bereits an anderen (i. allg. tierischen) Zellkulturmodellen, an transgenen Tieren bzw. an humanem Primärmaterial teils umfassend analysiert und sollen im Projekt nun zur Untersuchung und Validierung der Eignung des zu etablierenden, aus hES-Zellen abgeleiteten Zellkultursystems für die Modellierung des Chorea Huntington herangezogen werden. Die Einschätzung, ob und inwieweit das hier zu etablierende Zellkultursystem Eigenschaften von Zellen mit einem Chorea-Huntington-Phänotyp spiegeln kann, soll ferner unter Nutzung von Substanzen erfolgen, die in ebenfalls bereits bekannter Weise bestimmte Ausprägungen des für mHtt-MSN charakteristischen Phänotyps beeinflussen können.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Gegenstand der beantragten Forschungsarbeiten ist die Etablierung und Untersuchung eines Zellmodells für den Chorea Huntington beim Menschen. In der Vergangenheit wurde zwar gezeigt, dass auch auf der Grundlage tierischer Zellkultursysteme bzw. Tiermodelle verschiedene Aspekte der Huntingtonschen Krankheit untersucht werden können. Jedoch zeigten sich bei Verwendung dieser Tiermodelle auch deutliche Unterschiede in der Ausprägung sowie im Verlauf der Erkrankung im Vergleich zum Menschen. Entsprechende Defizite sind auch Zellkultursystemen inhärent, die beispielsweise aus der Maus oder aus nicht-humanen Primaten abgeleitet wurden. Derzeit vorliegende, auf tierischen Zellen beruhende Zellmodelle sind nach derzeitigem Kenntnisstand nicht in gleicher Weise wie menschliche Zellen zur Untersuchung von Aspekten der Huntingtonschen Krankheit geeignet, so dass zur Erreichung der Forschungsziele humane Zellen benötigt werden.

Andere Zellen menschlicher Herkunft sind für die Erreichung der formulierten Forschungsziele nicht in gleicher Weise wie hES-Zellen geeignet. Zum einen sollen mögliche Veränderungen im Phänotyp neuraler Zellen, die sich unter dem Einfluss der Präsenz von mHtt in den Zellen ergeben, ggf. bereits im Verlaufe der Differenzierung der Zellen detektiert werden. Dies schließt auch frühe Differenzierungsprozesse ein, die beispielsweise von neuralen Vorläuferzellen bereits durchlaufen worden sind. Bei der denkbaren Nutzung von (i. allg. aus abgetriebenen menschlichen Föten) gewonnenen neuralen Vorläuferzellen bestehen zudem erhebliche Einschränkungen hinsichtlich ihrer Verfügbarkeit in reproduzierbarer Qualität und in für die Durchführung des Projektes ausreichenden Mengen. Immortalisierte (fötale) neurale Vorläuferzellen des Menschen stellen aufgrund der ggf. mit der Immortalisierung einhergehenden Veränderungen in der Genexpression dieser Zellen und ihrer variierenden neuronalen Differenzierungskapazität ebenfalls keine Alternative zur Nutzung von hES-Zellen dar. Auch Primärkulturen aus Patienten mit Chorea Huntington können aufgrund ihrer geringen Proliferationsfähigkeit in vitro sowie ihrer schweren Zugänglichkeit nicht zur Erreichung der Forschungsziele verwendet werden.

Die formulierten Forschungsziele können nach derzeitigem Kenntnisstand auch nicht unter Nutzung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Nach wie vor ist nicht geklärt, inwieweit hiPS-Zellen zu hES-Zellen identische Eigenschaften aufweisen. Abgesehen von epigenetischen Unterschieden zwischen hES- und hiPS-Zellen, die subtile Unterschiede auch in der Expression differenzierungsrelevanter Gene bedingen könnten, liegen neuere Studien vor, in denen Unterschiede im neuralen Differenzierungsvermögen von hiPS- und hES-Zellen festgestellt worden sind. Zudem ist auch die Frage nach einem mutmaßlichen sog. epigenetischen Gedächtnis von hiPS-Zellen weiterhin offen. So ist derzeit nicht abschließend geklärt, ob zum Beispiel die üblicherweise aus Fibroblasten hergestellten hiPS-Zellen das vollständige neuronale Differenzierungspotential pluripotenter humaner Stammzellen aufweisen.

6. Genehmigte Erweiterungen des Forschungsvorhabens

Genehmigungserweiterung vom 18.02.2016

Die Genehmigungserweiterung bezieht sich auf die Durchführung folgender zusätzlicher Forschungsarbeiten:

Angaben zu den Forschungsarbeiten

Die genehmigten Arbeiten sollten ursprünglich ausschließlich an Zellen der von Chorea Huntington am stärksten betroffenen Zellpopulation, den sog. Medium-Spiny-Neuronen (MSN), durchgeführt werden. Nun sollen die Untersuchungen auch an anderen neuralen Zelltypen erfolgen, die bei Chorea Huntington ebenfalls einen veränderten Phänotyp aufweisen, deren Herstellung aus hES-Zellen aber effizienter und weniger zeitintensiv ist als jene von MSN. Ferner stehen seit kurzem genetisch modifizierte hES-Zellen zur Verfügung, in denen CAG-Trinukleotid-repeats verschiedener Länge in das Huntingtin-Gen eingeführt wurden („HTT-Allel-Serie“) und die bei neuraler Differenzierung voraussichtlich den Phänotyp der Chorea Huntington auf zellulärer Ebene abbilden können. Daher sollen im Rahmen der nun genehmigten Arbeiten Vorgehensweisen für die Differenzierung von hES-Zellen in bei Chorea Huntington betroffene neurale Zelltypen, beispielsweise kortikale Projektionsneurone, Astrozyten, Oligodendrozyten u. a., etabliert, die Zellen umfassend charakterisiert und der Phänotyp von aus wildtyp- und mutierten hES-Zellen abgeleiteten Zellen verglichen werden. Dabei sollen Charakteristika (Genexpressionsprofile, Aktivität von Signalwegen, posttranskriptionale Veränderungen) identifiziert werden, die in Abhängigkeit von der CAG-repeat-Länge auf zellulärer Ebene verändert sind und anschließend die Wirkung von (niedermolekularen) Substanzen auf diese Eigenschaften im Hochdurchsatzverfahren getestet werden. Ferner sollen – ebenfalls im Hochdurchsatzverfahren – Bibliotheken von siRNAs mit dem Ziel untersucht werden, Gene zu identifizieren, deren Produkte bei Vorliegen von HTT-Allel-Varianten mit einem veränderten zellulären Phänotyp in Zusammenhang stehen.

Hochrangigkeit der Forschungsziele

Hinsichtlich der Hochrangigkeit der Forschungsziele gelten die unter Punkt 4) genannten Argumente unverändert fort; die Untersuchungen werden lediglich auf andere neurale Zelltypen ausgedehnt. Hinzu kommen Fragestellungen, deren Untersuchung ebenfalls einen wichtigen Beitrag sowohl zum Erkenntnisgewinn in der Grundlagenforschung erbringen als auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen beitragen kann. Die angestrebte Untersuchung von HTT-Allel-Varianten vor einem isogenen Hintergrund kann besser als bislang möglich zur Klärung der Frage nach dem konkreten Effekt von Trinukleotid-repeats spezifischer Länge auf die molekularen und biochemischen Eigenschaften neuraler Zellen beitragen. So können Dosiseffekte quantitativ und qualitativ erfasst und auf diese Weise zum Verständnis darüber beigetragen werden, welchen Einfluss die Trinukleotid-repeat-Länge auf die Genexpression, die Aktivität von Signalwegen sowie auf die Ausprägung des für die Huntingtonsche Erkrankung spezifischen Phänotyps in menschlichen Neuronen hat. Diese Arbeiten werden voraussichtlich insgesamt das Verständnis der Pathogenese-Prozesse, die bei Chorea Huntington auf zellulärer Ebene ablaufen, vertiefen. Die geplanten Hochdurchsatzstudien an aus hES-Zellen abgeleiteten Neuronen, die CAG-Trinukleotid-repeats verschiedener Länge aufweisen, können zum einen ggf. zur Identifizierung von potentiell therapeutisch nutzbaren Substanzen führen, zum anderen – durch Analyse des Wirkmechanismus der dabei identifizierten Substanzen – weitere Erkenntnisse über die Pathogenese der Chorea Huntington auf zellulärer Ebene sowie über daran beteiligte Signalwege erbringen.

Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Forschungsvorhaben verfolgten Fragestellungen

Die Vorklärung der mit dem Vorhaben verfolgten wissenschaftlichen Zielstellungen, die durch die nunmehr genehmigten Forschungsarbeiten nicht grundsätzlich verändert sind, wurde im Rahmen des ursprünglichen Antragsverfahrens umfänglich dargelegt. Zusätzlich wurde dargelegt, auf welchem Wege die nunmehr benötigten neuralen Zelltypen aus hES-Zellen gewonnen werden sollen, dass eine HTT-Allel-Serie für die die hES-Zell-Linie RUES2 bereits verfügbar ist und dass die Rolle posttranslationaler Modifikationen von Huntingtin bereits im Mausmodell untersucht wurde. Ferner wurde dargelegt, dass die zusätzlichen Parameter, die im Rahmen der genehmigten Arbeiten analysiert werden sollen, bereits vom HD-Konsortium der ISSCR als für HD-Neuronen wesentlich bestimmt wurden.

Die Notwendigkeit, hES-Zellen zu verwenden, wurde bereits im ursprünglichen Antragsverfahren ausführlich begründet. Die damals vorgetragenen Argumente, dass keine anderen Zellen als pluripotente Stammzellen des Menschen zur Erreichung der Forschungsziele verwendet werden können, gelten unverändert fort. Zudem wurde erneut dargelegt, warum die Forschungsziele auch weiterhin nicht unter Verwendung von hiPS-Zellen erreicht werden können. Demnach haben verschiedene Studien gezeigt, dass genetische und epigenetische Variationen in iPS-Zell-Linien nicht nur deren Differenzierungsverhalten beeinträchtigen können, sondern ggf. auch die Krankheitsgenetik und vergleichende phänotypische Analysen nachteilig beeinflussen. Zudem sind die zur Nutzung vorgesehenen hES-Zellen der Linie RUES2 die derzeit einzigen verfügbaren humanen pluripotenten Stammzellen, die relevante HTT-Allel-Varianten für die Untersuchung phänotypischer Effekte von CAG-Trinukleotid-repeats in menschlichen Zellen beinhalten.

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