64. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Planck-Gesellschaft (Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin, Münster)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES 2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES 6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• NCL-3 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritannien)
• NCL-4 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritannien)
• Shef 3 (University Sheffield, Sheffield, Großbritannien)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linie(n).

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Arbeiten unter Nutzung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) ist die Untersuchung von Prozessen, die während der Differenzierung zu weiblichen Keimzellen des Menschen ablaufen. Dazu sollen hES-Zellen unter Verwendung und Optimierung bereits publizierter Protokolle in vitro zu primordialen Keimzellen (primordial germ cells, PGCs) differenziert und diese umfassend charakterisiert werden, insbesondere hinsichtlich ihres Transkriptoms, der Präsenz keimzellspezifischer Proteinmarker sowie epigenetischer Eigenschaften. Dazu sollen hES-Zellen mit Reportergenen versehen werden, die unter der Kontrolle von Promotoren in primordialen Keimzellen bzw. sich entwickelnden Eizellen exprimierter Gene stehen.

Im folgenden sollen dann die frühen Prozesse der Follikelbildung und Meiose in vitro untersucht und daran beteiligte Signaltransduktionswege analysiert werden. Hierbei sollen insbesondere die Rolle von Genen, deren knock out im Mausmodell die Meiose und die Follikelbildung hemmen, bei der Entwicklung menschlicher Eizellen aufgeklärt werden. Humane PGCs sollen im weiteren auch mit Granulosazellen bzw. den somatischen Zellen der Ovarien neonataler Mäuse gemischt und als Aggregate in vitro kultiviert werden, um den Einfluss einer natürlichen Nische auf die Keimzellentwicklung nachzubilden. Ferner sollen diese Aggregate auch nach Transplantation unter die Nierenkapsel von Nacktmäusen hinsichtlich der Frage untersucht werden, ob und inwieweit diese Nische die weitere Entwicklung und Reifung humaner Oozyten begünstigt. Alle Untersuchungen sollen im Vergleich zwischen hES- und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erfolgen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie der Erweiterung von Kenntnissen bei der Entwicklung diagnostischer, präventiver oder therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Bislang liegen keine publizierten Untersuchungen vor, in denen eine effiziente In-vitro-Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in postmeiotische Keimzellen erreicht werden konnte. hES-Zellen konnten zwar in verschiedenen Studien in primordiale Keimzellen (primordial germ cells, PGCs) bzw. keimzellähnliche Zellen (germ cell like cells GCLCs) differenziert werden. Jedoch können die sich daran anschließenden Entwicklungsschritte weiblicher humaner Keimzellen wie die Follikelbildung und die Meiose derzeit in vitro nicht nachvollzogen werden und sind folglich wenig verstanden. Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, diese Prozesse unter Einsatz neuer Vorgehensweisen zu analysieren und auf diesem Wege zu einem vertieften Verständnis von der Entwicklung weiblicher menschlicher Keimzellen und deren möglicher Störungen zu gelangen.

Durch die beabsichtigte Differenzierung von hES-Zellen zu PGCs sollen das Verständnis für frühe Prozesse der menschlichen Keimzellentwicklung vertieft und insbesondere daran beteiligte Moleküle und Signalwege identifiziert werden. Durch die Untersuchung der Frage, ob und inwieweit sich aus hES-Zellen gewonnene PGCs in vitro zu postmeiotischen Keimzellen weiterentwickeln lassen, sollen dann Prozesse aufgeklärt werden, die für die Entwicklung und Reifung späterer Stadien weiblicher Keimzellen bedeutsam sind.  Durch die geplante Ko-Kultuivierung von aus hES-Zellen gewonnenen PGCs mit somatischen Zellen aus (murinem) follikulärem oder ovariellem Stromagewebe soll der mögliche Einfluss einer natürlichen Nische, in der sich Keimzellen in vivo entwickeln, auf die Prozesse der Follikelbildung besser verstanden werden. Ferner soll durch vergleichende Analysen des Transkriptoms und des Epigenoms von Zellen aus unterschiedlichen Phasen der Keimzellentwicklung Netzwerke von Genexpression, von zellulärer Signaltransduktion und von Vorgängen auf epigenetischer Ebene identifiziert werden, die für die Oogenese beim Menschen essentiell sind. Auf diese Weise könnten Gene bestimmt werden, deren Expression zum Eintritt in die Meiose führt oder die Fähigkeit der PGCs zur Follikelbildung und/oder Meiose beeinflusst. Ferner sind Erkenntnisse darüber zu erwarten, welche Keimzellmarker während bestimmter Phasen der Keimzellentwicklung auftreten und von welchen epigenetischen Veränderungen die verschiedenen Stadien der Keimzellentwicklung begleitet werden. Einem vertieften Verständnis über Interaktionen der reifenden Oozyte mit ihrer Umgebung in vivo dienen jene Projektteile, in denen Aggregate, beispielsweise aus humanen PGCs und murinen ovariellen Stromazellen, unter die Nierenkapsel weiblicher SCID-Mäuse transplantiert werden sollen. Aus diesen Experimenten wird Aufschluss darüber erwartet, inwieweit eine endogene Nische auf die Entwicklung der Eizellreifung Einfluss nimmt.

Die geplanten Untersuchungen unter Verwendung von hES-Zellen könnten im Ergebnis auch zur Etablierung von neuen In-vitro-Systemen führen, mit deren Hilfe neue Erkenntnisse über Ursachen der weiblichen Sterilität gewonnen werden können. Bislang stehen für diese Untersuchungen keine humanspezifischen Modellsysteme zur Verfügung, an denen molekulare und zellbiologische Ursachen für Infertilitätsstörungen infolge vorzeitiger Ovarialinsuffizienz oder primärer Amenorrhoe untersucht werden könnten. Ein auf hES-Zellen basierendes Differenzierungsmodell könnte künftig genutzt werden, um (beispielsweise durch gezielte Ausschaltung von an der Eizellenreifung beteiligten Genprodukten) molekulare Ursachen für Fertilitätsstörungen zu bestimmen und ggf. neue Wirkstoffe zur Behandlung entsprechender Krankheiten zu entwickeln.

Im Forschungsvorhaben sollen, parallel zu hES-Zellen, auch hiPS-Zellen hinsichtlich ihrer Differenzierbarkeit in Keimzellen analysiert werden. Aus diesen Untersuchungen sind wesentliche Erkenntnisse darüber zu erwarten, ob und inwieweit sich hES- und hiPS-Zellen bezüglich ihrer Differenzierbarkeit in weibliche Keimzellen gleichen bzw. ob und welche Unterschiede auftreten. Die grundsätzliche Klärung der Frage nach dem Keimzellpotential humaner iPS-Zellen, die unter vergleichender Verwendung von hES-Zellen erfolgen soll, ist Voraussetzung für weitere geplante Untersuchungen, bei denen beispielsweise patientenspezifische hiPS-Zellen aus Personen mit primärer ovarieller Insuffizienz generiert und diese Zellen anschließend hinsichtlich molekularer und zellbiologischer Ursachen für Defekte bei der Keimzellentwicklung untersucht werden sollen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und der Übergang zur Nutzung humaner ES-Zellen folglich gerechtfertigt ist.

Protokolle für die Differenzierung muriner ES-Zellen in weibliche Keimzellen sind aus der Literatur seit längerem bekannt. So wurde in einer grundlegenden Arbeit aus dem Jahr 2003, die von den mit den genehmigten Arbeiten befassten Wissenschaftlern veröffentlicht wurde, das Potential muriner ES-Zellen zur Bildung eizellartiger Zellen nachgewiesen. Weitere Arbeiten, beispielsweise zur Ultrastruktur aus murinen ES-Zellen gewonnener eizellartiger Zellen zeigten, dass diese in vitro von Granulosazellen umgeben sind und Eizellen ähneln, die aus Follikeln erwachsener Mäuse isoliert wurden. Aus verschiedenen In-vivo-Studien ist zudem bekannt, dass somatische Granulosazellen die Oogenese im Maus­modell fördern. Weiterhin wurde in Mausmodellen nachgewiesen, dass (genetische) Defekte der primordialen Keimzellentwicklung und Meiose zur Sterilität weiblicher Mäuse führten. Über diese Ergebnisse aus dem murinen System hinaus liegt mittlerweile auch eine umfangreiche Literatur zum Keimzellpotential humaner ES-Zellen vor, wobei hES-Zellen, wenn auch mit stark variierender Effizienz, in vitro zu PGCs bzw. GLCs differenziert wurden.

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Pluripotente Stammzellen der Maus unterscheiden sich von jenen des Menschen hinsichtlich der Oberflächenmoleküle und der Signalwege, die Pluripotenz kontrollieren. Insofern kann davon ausgegangen werden, dass auch frühe Prozesse der Differenzierung in Richtung PGCs sowie die Keimzellbildung einleitende Faktoren im humanen und murinen System nicht identisch sind. Auch aufgrund der erheblichen Unterschiede in der zeitlichen Koordinierung der Abläufe bei der Eizellreifung zwischen Maus und Mensch ist nicht zu erwarten, dass an Mauszellen gewonnene Erkenntnisse ohne weiteres auf das humane System übertragbar sind. Die Zielsetzung des geplanten Forschungsvorhabens, Prozesse der Keimzellentwicklung des Menschen zu untersuchen, erfordert daher die Verwendung humaner Zellen.

Die Notwendigkeit der Verwendung embryonaler Stammzellen des Menschen ergibt sich aus dem Forschungsziel, frühe Prozesse der menschlichen Keimzellentwicklung zu verstehen. Vorgänge, die bei der Spezifizierung von pluripotenten Zellen zu Keimzellen sowie bei der Entwicklung von PGCs beim Menschen ablaufen, erfordern die Nutzung eines nicht-determinierten menschlichen Zelltyps. Das sind nach gegenwärtiger Kenntnis allein hES-Zellen. Für die weiteren im Projekt geplanten Untersuchungen wäre es zwar theoretisch vorstellbar, primordiale Keimzellen aus abgetriebenen Föten oder primäre Zellen aus Ovarialgewebe von weiblichen neugeborenen Kindern und jungen Frauen zu verwenden. Dieses Material, wenn es überhaupt zur Verfügung stünde, könnte jedoch aufgrund des jeweils unterschiedlichen Entwicklungsgrades der Keimzellen und der folglich nicht zu gewährleistenden Reproduzierbarkeit für die geplanten Untersuchungen keine Alternative zu nach standardisierten und optimierten Protokollen aus hES-Zellen gewonnenen frühen Keimzellen darstellen.

Die im Forschungsvorhaben angestrebten Zielstellungen lassen sich auch nicht durch ausschließliche Nutzung von hiPS-Zellen erreichen. hiPS-Zellen sollen im vorliegenden Projekt erst hinsichtlich ihrer Fähigkeit, in PGCs und weiter in weibliche Keimzellen zu differenzieren, untersucht und bezüglich ihres Keimzellpotentials mit hES-Zellen verglichen werden. Es ist derzeit offen, ob sie dabei Entwicklungsprozesse von Keimzellen in gleicher Weise widerzuspiegeln vermögen wie hES-Zellen.

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