76. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Herr Prof. Dr. Heiko Lickert, Helmholtz Zentrum München

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H13 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H14 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-1 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-2 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HS181 (Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden)
• HS401 (Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden)
• HS415 (Karolinska-Institut, Stockholm, Schweden)
• HUES2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES4 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• SA001 (Cellartis, AB, Göteborg, Schweden)
• SA002 (Cellartis, AB, Göteborg, Schweden)
• Shef-3 (Universität Sheffield, Großbritannien)

Im Rahmen der Erweiterung der Genehmigung vom 14.12.2015 wurden zur Durchführung der unten benannten Forschungsarbeiten die Einfuhr und Verwendung humaner embryonaler Stammzellen der folgenden weiteren Linie genehmigt:

• MEL-1 (Stem Cells Ltd, Brisbane, Australien)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand des ersten Teilprojektes der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen ist die Etablierung von effizienten Vorgehensweisen für die Gewinnung von funktionellen Beta-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) mit dem Ziel, ausreichende Mengen dieser Zellen reproduzierbar und in hoher Qualität aus verschiedenen hES-Zell-Linien gewinnen zu können. Dazu sollen zunächst hES-Zellen genetisch so modifiziert werden, dass die Aktivität von für die entodermale Differenzierung wesentlichen Transkriptionsfaktoren über Reportergenaktivitäten angezeigt werden kann. Durch den Transfer eines weiteren Reportergens sollen dann hES-Zell-Linien erzeugt werden, in denen die Proliferationsaktivität der Zellen über eine weitere Reportergenaktivität verfolgt werden kann. Mittels dieser (transgenen) hES-Zellen sollen dann zum einen durch ein Screening von Bibliotheken niedermolekularer Substanzen Moleküle identifiziert werden, die die entodermale Differenzierung humaner ES-Zellen auslösen bzw. verstärken können. Zum anderen sollen proliferationskompetente Subpopulationen entodermaler Vorläuferzellen identifiziert und charakterisiert werden, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung insulinproduzierender, Beta-Zell-ähnlicher Zellen dienen können. Die aus hES-Zellen gewonnenen Beta-Zellen sowie ihre Vorläufer sollen umfassend bezüglich ihrer molekularen und funktionellen Eigenschaften in vitro und im Tiermodell charakterisiert werden. Die an hES-Zellen gewonnenen Resultate sollen dann auf humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) übertragen werden.

In einem zweiten Teilprojekt sollen hES-Zellen zu Vergleichszwecken für die Charakterisierung des entodermalen und pankreatischen Differenzierungspotentials von hiPS-Zellen dienen, die aus Patienten mit Mutationen in den sog. MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young)-Genen gewonnen werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten an hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung sowie und können darüber hinaus zur Schaffung von Grundlagen für die Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen beitragen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Ziel des beantragten Vorhabens ist es, reife pankreatische Beta-Zellen aus hES-Zellen in vitro reproduzierbar und in großer Reinheit und Menge zu gewinnen, um diese später als Ausgangsmaterial für Zellersatztherapien und zur Beantwortung von weiteren Forschungsfragen, beispielsweise im Zusammenhang mit der Pathogenese des Diabetes mellitus, beantworten zu können.

Gegenwärtig gibt es kein bona fide-Protokoll zur In-vitro-Differenzierung pluripotenter menschlicher Stammzellen in pankreatische Beta-Zellen. Zwar können mittlerweile pankreatische Vorläuferzellen in vitro aus hES-Zellen gewonnen werden, jedoch reifen diese nur nach Transplantation in die Maus innerhalb mehrerer Monate zu funktionellen endokrinen Zellen aus. Eine weitere Differenzierung in vitro führt bislang regelmäßig zu Zellen, die mehrere Hormone produzieren, jedoch nach Glukose-Stimulation nicht die für reife Beta-Zellen typischen Mengen an Insulin sekretieren und somit eher einem ursprünglichen Beta-Zell-Vorläufer ähneln. Ein erstes und vorrangiges Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist daher die Entwicklung verbesserter Protokolle für die Gewinnung von Zellen des definitiven Entoderms (DE-Zellen) aus hES-Zellen sowie die Etablierung entsprechender stabil proliferierender Vorläuferzell-Linien. Bisherige Protokolle zur Herstellung von DE-Zellen, die vor allem auf der Induktion der entodermalen Differenzierung durch Activin A und Wnt3a beruhen, sind teils schlecht reproduzierbar und führen in hES-Zellen mit verschiedenem genetischem Hintergrund zu unterschiedlichen Differenzierungserfolgen. Durch die geplante Identifizierung von (kleinen) Molekülen, die die entodermale Differenzierung einleiten oder verstärken können, sollen besser reproduzierbare Protokolle für die entodermale Differenzierung etabliert werden, die zum einen eine gleichmäßige Differenzierung von genetisch unterschiedlichen hES-Zellen ermöglichen und zum anderen die Expansion und Differenzierung dieser Zellen ohne Nutzung von feeder-Zellen ermöglichen. Die Analyse der Signalwege, in die solche Moleküle eingreifen, sowie die Identifikation von beteiligten Rezeptoren und intrazellulären Wechselwirkungspartnern können voraussichtlich Einblicke in molekulare Grundlagen der frühen entodermalen Differenzierung beim Menschen geben.

Weiteres Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, durch Variation der Differenzierungs- und Kultivierungsbedingungen eine Population expandierbarer (früher) entodermaler Vorläuferzellen zu identifizieren, die sich reproduzierbar aus vielen genetisch verschiedenen hES-Zell-Linien gewinnen lässt und als Ausgangspunkt für die effektive Differenzierung in pankreatische Vorläuferzellen dienen kann. Die Verfügbarkeit derartiger Zellen ist ggf. eine Voraussetzung für die Herstellung von für künftige therapeutische Anwendungen ausreichenden Mengen transplantierbarer pankreatischer Vorläuferzellen bzw. reifer Beta-Zellen. Durch die geplante Transplantation von aus (stabilen) DE-Zell-Populationen gewonnenen pankreatischen Vorläuferzellen in Mausmodelle des Diabetes mellitus soll zudem nachgewiesen werden, dass diese Vorläuferzellen das Potential zur Reifung in Glukose-stimulierbare, Insulin-sekretierende Beta-Zellen haben und damit prinzipiell in künftigen Zellersatztherapien des Diabetes mellitus verwendet werden können.

Ein weiterer Schwerpunkt der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Verwendung von hES-Zellen als Referenzmaterial für die Einschätzung des pankreatischen Differenzierungsvermögens bzw. für die Identifizierung und Analyse von Differenzierungsdefekten bei von MODY-Diabetes betroffenen Zellen. MODY-Diabetes ist eine seltene Form des Diabetes mellitus, die sich bereits im Kindesalter manifestieren kann und auf Mutationen in verschiedenen Genen zurückgeführt wird, deren Produkte ggf. im Zusammenhang mit der Beta-Zell-Differenzierung stehen. Durch Analyse des entodermalen und pankreatischen Differenzierungsverhaltens von hiPS-Zellen aus Patienten mit verschiedenen Formen von MODY-Diabetes und Vergleich mit von deren Differenzierungsverhalten mit jenem von hES-Zellen sollen Erkenntnisse über mögliche Veränderungen im Phänotyp von (entodermalen und pankreatischen) Vorläuferzellen bei MODY-Patienten sowie deren molekulare Ursachen gewonnen werden. Dies kann im Ergebnis voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen beitragen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Der Genehmigungsinhaber selbst hat sehr umfangreiche Arbeiten zur frühen entodermalen Differenzierung im Maussystem durchgeführt und publiziert, wobei u. a. entodermale Vorläuferzellen isoliert und FoxA2 als wesentlicher Marker entodermaler Stammzellen identifiziert wurden. Es wurde dargelegt, dass vom Genehmigungsinhaber unter Nutzung eines auf murinen ES-Zellen basierenden Screens in einer Bibliothek von 25.000 Substanzen 50 Moleküle identifiziert wurden, die die frühe entodermale Differenzierung muriner ES-Zellen stimulieren bzw. verstärken können. Diese Substanzen sollen nunmehr auf ihre differenzierungsfördernden Eigenschaften im humanen System hin untersucht werden. Da sich frühe entodermale Differenzierungsprozesse in der Maus und im Menschen ggf. unterscheiden können, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass keines der im Maussystem identifizierten Moleküle eine entsprechende Wirkung im humanen System zeigt bzw. im humanen System wirksame Substanzen in einem auf Mauszellen basierenden Screening nicht erfasst wurden. Aus diesem Grund soll das Screening, dessen grundsätzliche Eignung zur Identifizierung wirksamer Substanzen unter Nutzung von ES-Zellen der Maus gezeigt wurde, unter Nutzung von hES-Zellen ggf. erneut durchgeführt werden.

Weiterhin wurde im Antragsverfahren dargelegt, dass auf murinen ES-Zellen basierende transgene Zell-Linien, bei denen ein Reportergen in den FoxA2-Locus integriert wurde, zum einen die Nachverfolgung von frühen Differenzierungsentscheidungen auf zellulärer Ebene und zum anderen die Identifizierung und Charakterisierung entodermaler Vorläuferzellen ermöglichte. Methoden für die entodermale und pankreatische Differenzierung von hES-Zellen sind aus der Literatur bekannt und sollen im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten optimiert und weiterentwickelt werden. Gleiches gilt für die Methoden zur Generierung genetisch veränderter hES-Zellen, beispielsweise durch homologe Rekombination oder durch von Zinkfinger-Nukleasen vermittelten Gentransfer. Die Vorgehensweisen zur Charakterisierung der pankreatischen (Vorläufer)Zellen sowie die zum Einsatz kommenden Tiermodelle sind ebenfalls etabliert und in der Literatur vielfach beschrieben. hiPS-Zellen aus Patienten mit Mutationen in verschiedenen MODY-Genen wurden bereits in der Vergangenheit etabliert und bezüglich ihrer Pluripotenz, nicht jedoch in Hinblick auf ihr Differenzierungsverhalten charakterisiert. Die Relevanz von Mutationen bestimmter MODY-Gene für die Entstehung eines diabetischen Phänotyps wurde zudem in mehreren Mausmodellen nachgewiesen.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Langfristiges Ziel des Forschungsvorhabens ist die Bereitstellung von Zellen für eine Zellersatztherapie des Diabetes mellitus. Dies erfordert die Nutzung menschlicher Zellen. Zudem unterscheiden sich tierische und menschliche embryonale Stammzellen teilweise bezüglich ihres Entwicklungsstadiums, ihres Differenzierungspotentials, der Differenzierungsdauer, der für die Differenzierung benötigten Faktoren und der daran beteiligten Signalwege, so dass die Optimierung der (letztlich auf humane Zellen anzuwendenden) Protokolle und Vorgehensweisen nur an humanen Zellen erfolgen kann.

Die geplanten Untersuchungen können ferner nicht unter Verwendung humaner adulter oder fötaler Stammzellen erfolgen. Wesentliches Forschungsziel ist die Identifizierung von (stabil proliferierenden) entodermalen Zellen, die für FoxA2 positiv sind. FoxA2 ist ein Marker des Mesentoderms sowie des definitiven Entoderms, also von Stadien der entodermalen Differenzierung, die fötale und adulte Stammzellen bereits durchlaufen haben. Ferner ist die Gewinnung von endokrinen pankreatischen Vorläuferzellen sowie reifen Beta-Zellen in reproduzierbarer Qualität sowie in für künftige Zellersatztherapien erforderlichen Mengen unter Verwendung adulter oder fötaler Stammzellen des Menschen nach gegenwärtigem Kenntnisstand nicht möglich.

Die Forschungsziele können auch nicht unter ausschließlicher Nutzung von hiPS-Zellen erreicht werden. Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass hiPS-Zellen nach dem bisherigen Stand der Literatur ein deutlich geringeres Differenzierungsvermögen in pankreatische Zellen aufweisen als die bislang untersuchten hES-Zellen. Es ist ferner nicht bekannt, ob und inwieweit gerade frühe Differenzierungsprozesse, die im Rahmen der hier beantragten Forschungsarbeiten untersucht werden sollen, durch die in der Literatur beschriebenen Unterschiede im Genom und Epigenom von hES- und hiPS-Zellen beeinflusst werden können. Es ist zudem gerade ein Schwerpunkt des Forschungsvorhabens, Methoden für die entodermale und pankreatische Differenzierung zu etablieren, die mit gleichem Erfolg auf hES-Zellen verschiedener Provenienz und auf hiPS-Zellen (also auf pluripotente Stammzellen des Menschen insgesamt) angewendet werden können, was die Nutzung von hES-Zellen ebenfalls erforderlich macht.

nach oben