83. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaberin

Frau Prof. Dr. Katja Schenke-Layland, Universitätsklinikum Tübingen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten basieren auf humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) der folgenden Linien:

• H9 (Wicell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-2 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für die Einfuhr und Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung humaner embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) ist die Untersuchung des Einflusses von Bestandteilen der extrazellulären Matrix (extracellular matrix, ECM) auf die frühe kardiale Differenzierung. Dazu sollen aus ES-Zellen zunächst embryoid bodies (EBs) gewonnen werden, die einen hohen Anteil spontan kontraktierender (kardialer) Zellen aufweisen. Durch Verwendung eines schonenden Dezellularisierungsprotokolls, das neben den strukturellen Komponenten auch Proteoglykane und matrizelluläre Proteine erhält, soll die ECM dieser EBs zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung isoliert und bezüglich ihrer Zusammensetzung untersucht werden, wobei ggf. neue ECM-Komponenten identifiziert und in einem hES-Zell-basierten In-vitro-Modell auf ihre Relevanz für die frühe kardiale Differenzierung hin überprüft werden sollen. Im Anschluss daran sollen Rezeptoren und Signalwege untersucht werden, die mit den identifizierten ECM-Komponenten im Zusammenhang stehen. Insbesondere sollen der Effekt einer Repression der entsprechenden Gene auf die kardiale Differenzierung überprüft und damit die Relevanz bestimmter Rezeptoren und Signalwege für die ECM-vermittelte Differenzierungsinduktion aufgeklärt werden. Schließlich sollen die komplexe (aus sich kardial differenzierenden hES-Zellen gewonnene) ECM und eine artifizielle ECM, die zuvor identifizierte Schlüsselproteine der frühen kardialen ECM enthält, bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht werden, die kardiale Differenzierung von hES-Zellen zu unterstützen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung und des RKI hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung und können darüber hinaus zur Schaffung von Grundlagen für die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen beitragen. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Effiziente Protokolle für die kardiale Differenzierung pluripotenter Stammzellen sind sowohl für künftige regenerative therapeutische Ansätze als auch für das Verständnis von den molekularen Prozessen der Herzentwicklung beim Menschen erforderlich. Dabei kommt extrazellulären Signalen, die zum Teil aus Bestandteilen der ECM in die sich differenzierenden Zellen vermittelt werden, eine Schlüsselrolle zu. Die genehmigten Forschungsarbeiten zielen darauf, Veränderungen in der Zusammensetzung der ECM während der kardialen Differenzierung von hES-Zellen zu analysieren, die für eine effiziente kardiale Differenzierung wesentlichen ECM-Bestandteile zu bestimmen bzw. deren Relevanz für die kardiale Differenzierung zu verifizieren sowie Rezeptoren und Signalübertragungswege zu identifizieren, die an der Vermittlung induktiver Effekte der ECM in sich differenzierende hES-Zellen beteiligt sind.

Die Analyse der ECM, die von sich kardial differenzierenden hES-Zellen gebildet wird, soll zu detaillierten Kenntnissen über Komponenten dieser ECM führen. Der beabsichtigte Vergleich der Zusammensetzung der von hES-Zellen und von sich kardial differenzierenden Zellen sekretierten ECM kann zum einen Erkenntnisse über jene ECM-Komponenten erbringen, die für die frühe kardiale Differenzierung erforderlich sind. Zum anderen können sich – beispielsweise aus einem beobachteten Verlust bestimmter ECM-Bestandteile während der Differenzierung – auch Erkenntnisse über Bestandteile der ECM ergeben, die für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustandes von hES-Zellen erforderlich sind, im Zuge der Differenzierung der Zellen aber abgebaut werden. Der geplante Vergleich der Zusammensetzung der in kardialem Herzgewebe des Menschen vorhandenen mit der von sich kardial differenzierenden Zellen gebildeten ECM soll Erkenntnisse darüber erbringen, welche ggf. wesentlichen ECM-Bestandteile von sich in vitro aus hES-Zellen differenzierenden kardialen Zellen derzeit nicht produziert werden können. Dies könnte ggf. zum Verständnis darüber beitragen, warum die derzeit verfügbaren Protokolle für die kardiale In-vitro-Differenzierung von hES-Zellen bislang nur zu unreifen kardialen Zellen führen, die einen weitgehend fötalen Phänotyp aufweisen.

Die beabsichtigte Untersuchung der Frage, über welche Rezeptoren bzw. Signalübertragungswege der induktive Effekt bestimmter ECM-Komponenten auf die kardiale Differenzierung vermittelt wird, kann zu neuen Kenntnissen über die molekularen Grundlagen induktiver Effekte der ECM sowie daran beteiligter Moleküle, Rezeptoren und Signalübertragungswege führen. Dies könnte zu einem besseren Verständnis der Rolle der ECM in der kardialen Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen beitragen. Aus diesen Erkenntnissen lassen sich ggf. auch Rückschlüsse auf Prozesse der frühen kardialen Entwicklung im menschlichen Embryo ziehen, die sich auf anderem Wege nicht gewinnen lassen.

Die angestrebten Erkenntnisse zur Zusammensetzung der kardialen ECM während verschiedener Phasen der Differenzierung können ferner zur Entwicklung verbesserter In-vitro-Protokolle für die kardiale Differenzierung von menschlichen Stammzellen und damit zur künftigen Bereitstellung transplantierbaren kardialen Gewebes beitragen. So ist bereits im Vorhaben vorgesehen, Trägermaterialien mit für die kardiale Differenzierung als wesentlich erkannten ECM-Proteinen zu beschichten und deren Einfluss auf die kardiale Differenzierung in vitro im Detail zu bestimmen. Bereits in der Vergangenheit war gezeigt worden, dass die Injektion eines aus der ECM des Schweineherzens hergestellten Hydrogels in das infarzierte Schweineherz zu einer Verbesserung verschiedener kardialer Parameter führte. Die Kenntnis über kritische Bestandteile der humanen kardialen ECM kann ggf. also auch zu neuen Therapieansätzen führen, die nicht auf der Verwendung von Stammzellen und daraus abgeleiteten Zellen, sondern ausschließlich auf rekombinant hergestellten ECM-Proteinen beruhen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen em­bryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt und die Nutzung humaner ES-Zellen gerechtfertigt ist.

Die zentrale Rolle von ECM-Bestandteilen für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz humaner ES-Zellen sowie für die Induktion und das Fortschreiten ihrer Differenzierung in verschiedene Zelltypen ist in der wissenschaftlichen Literatur gut belegt. So wurde beispielsweise gezeigt, dass nicht nur das Wachstum von hES-Zellen als pluripotente Zellen, sondern auch ihre Differenzierung in neurale Zellen, in Zellen des definitiven Entoderms oder in retinale Pigmentepithel-Zellen die Präsenz spezifischer ECM-Komponenten erfordert, die – als rekombinante Proteine auf Trägermaterialien aufgebracht – lösliche Wachstumsfaktoren zum Teil ersetzen können. In Bezug auf die kardiale Differenzierung wurde insbesondere nachgewiesen, dass die ECM im Laufe des Differenzierungsprozesses einer andauernden Umgestaltung unterliegt. Ferner hat die Genehmigungsinhaberin in eigenen Arbeiten, die in den USA durchgeführt worden sind, gezeigt, dass die ECM sich kardial differenzierender hES-Zellen bestimmte ECM-Proteine in größeren Mengen enthält als die ECM undifferenzierter hES-Zellen.

Die Analyse von ECM-Proteomen und die anschließende Überprüfung des Effektes der auf diesem Wege identifizierten ECM-Bestandteile auf die Differenzierung hat in der Vergangenheit bereits zur Identifizierung von ECM-Komponenten beitragen, die beispielsweise von feeder-Zellen produziert werden und für das Wachstum von hES-Zellen notwendig sind. Die Methodik zur Herstellung von embryoid bodies, die einen sehr hohen Anteil spontan kontraktierender Zellen aufweisen, wurde von der Genehmigungsinhaberin im Rahmen eines in der Vergangenheit in den USA durchgeführten Forschungsvorhabens selbst entwickelt. Ferner wurde dargelegt, dass die Injektion von ECM-Proteinen in das infarzierte Herz im Tierversuch zur Verbesserung verschiedener kardialer Parameter führte, was die erhebliche Bedeutung der ECM für regenerative Prozesse im Herzen unterstreicht und die Annahme plausibilisiert, durch Identifikation humaner kardialer ECM-Bestandteile einen Beitrag zur Entwicklung von Grundlagen für künftige therapeutische Ansätze leisten zu können.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erforderlichkeit der Verwendung menschlicher Zellen ergibt sich bereits aus den unterschiedlichen Bedingungen (und damit verbundenen verschiedenen extrazellulären Signalen), die für die Kultivierung humaner und tierischer (beispielsweise muriner) pluripotenter Stammzellen erforderlich sind. Der Übergang vom pluripotenten in einen stärker differenzierten Zustand erfordert daher in Zellen verschiedener Spezies voraussichtlich jeweils teils unterschiedliche differenzierungsinduzierende Signale der ECM. Kenntnisse zum differenzierungsabhängigen Umbau der ECM während der frühen kardialen Differenzierung menschlicher Zellen lassen sich folglich nur unter Verwendung menschlicher Zellen gewinnen. Zudem bestehen erhebliche Unterschiede in der Physiologie des Herzens (Schlagfrequenz, Druckverhältnisse etc.) insbesondere zwischen Nagetieren und Menschen, was mit gravierenden Unterschieden in den Anforderungen an die jeweilige ECM verbunden ist. Ferner hat die Genehmigungsinhaberin dargelegt, dass die Deposition von bestimmten ECM-Bestanteilen in den Klappentaschen des Menschen während der fötalen Entwicklung deutlich früher stattfindet, als es die Extrapolation entsprechender Daten aus dem Mausmodell erwarten ließe, was auf weitere Unterschiede in der ECM sich entwickelnder Herzen verschiedener Spezies hinweist..

Die Forschungsziele können nach derzeitigem Kenntnisstand auch nicht unter Verwendung adulter oder fötaler Stammzellen des Menschen erreicht werden. Das Forschungsvorhaben bezieht sich in großen Teilen auf Fragen der ECM-Zusammensetzung während der frühen kardialen Entwicklung menschlicher Zellen. Dieses Entwicklungsstadium haben sowohl fötale kardiale Zellen als auch adulte Stammzellen aber bereits durchlaufen, so dass sie zur Untersuchung dieser Fragestellung nicht geeignet sind.

Die Forschungsziele sind nach derzeitigem Kenntnisstand auch nicht unter Verwendung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichbar. hiPS-Zellen haben ein stark variierendes kardiales Differenzierungspotential, was unter anderem durch den variierenden Ursprung der für die Reprogrammierung verwendeten Zellen, durch das Alter des jeweiligen Zellspenders und durch die verschiedenen Reprogrammierungsmethoden bedingt sein kann. Es besteht derzeit keine Klarheit darüber, ob und inwieweit die Unterschiede zwischen hES-Zellen und hiPS-Zellen bezüglich ihres Genexpressionsprofils, der Präsenz spezifischer miRNAs sowie ihres Epigenoms für die jeweiligen biologischen Eigenschaften relevant sind. Publizierte Ergebnisse über die von sich kardial differenzierenden hiPS-Zellen gebildete ECM und deren Komponenten liegen derzeit nicht vor, so dass nicht belegt ist, dass sich hiPS-Zellen und hES-Zellen bezüglich ihrer Reaktion auf induktive Signale der ECM identisch verhalten. Aus Untersuchungen an hiPS-Zellen kann folglich nicht auf entsprechende Prozesse in hES-Zellen und damit auf Vorgänge während der frühen Kardiogenese in der Embryonal- und Fötalentwicklung des Menschen geschlossen werden.

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