124. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Planck-Gesellschaft, Institut für Psychiatrie, München

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES8 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Hintergrund des Forschungsvorhabens ist die Hypothese, dass eine insbesondere durch Stress vermittelte Ausschüttung von Glukokortikoiden zu Veränderungen in der Neurogenese bzw. in den Eigenschaften neuronaler Zellen des Zentralnervensystems führt und auf diesem Wege die Entwicklung psychiatrischer Erkrankungen verursachen bzw. begünstigen kann. Konkreter Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Untersuchung des Einflusses von Glukokortikoiden auf die Entwicklung und Eigenschaften humaner neuronaler Zellen und Organoide in vitro. Dazu sollen hES-Zellen nach etablierten und ggf. zu optimierenden Protokollen in neuronale Zellen, insbesondere in kortikale und hippocampale Neurone, sowie zu Gehirn-Organoiden differenziert und die Integrität der entstandenen Zellen/Organoide durch umfangreiche Analysen bestätigt werden. Dabei sollen auch die Präsenz, Lokalisation und Funktionalität des Glukokortikoid-Rezeptors in hES-Zellen und in aus diesen differenzierten neuronalen Zellen untersucht werden. Im folgenden sollen diese Untersuchungen dann in Präsenz von Glukokortikoiden erfolgen und mögliche Veränderungen in den differenzierten bzw. sich differenzierenden Zellen bestimmt werden. Neben Effekten auf Proliferation, Überlebensrate, Migration und Dendritenbildung soll insbesondere der Einfluss von Glukokortikoiden auf das Transkriptom und das Epigenom der jeweiligen neuronalen (Vorläufer)Zellen durch RNA-Sequenzierung, Methylierungsanalysen und genomische Analysen im Detail ermittelt werden. Zudem soll untersucht werden, ob es infolge der Wirkung von Glukokortikoiden zu Veränderungen im DNA-Bindungs-Spektrum des Glukokortikoidrezeptors kommt.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Das Forschungsvorhaben wird auf Grundlage zahlreicher experimenteller Befunde durchgeführt, nach denen vorgeburtlicher Stress mit einem deutlich erhöhten Risiko verbunden ist, im weiteren Verlaufe des Lebens psychiatrische Erkrankungen zu entwickeln. Dabei spielt die Exposition gegenüber großen Mengen an Glukokortikoiden, die von der Mutter infolge von Stress ausgeschüttet werden können, eine ggf. maßgebliche Rolle. Eine Korrelation zwischen stressbedingt erhöhten Mengen an Glukokortikoiden im Blut, veränderten Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen und der Entwicklung psychiatrischer Erkrankungen besteht auch im Erwachsenenalter fort.

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Untersuchung der Fragestellung, ob und inwieweit Glukokortikoide die Entwicklung und Eigenschaften neuronaler Zellen des Menschen in vitro beeinträchtigen, auf welcher Ebene Effekte beobachtet werden können und auf welche Weise dies zu Fehlentwicklungen bzw. Fehlfunktionen führt. Für diese Untersuchungen sollen humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) in bestimmte Typen von Neuronen (insbesondere kortikale und hippocampale Neurone) differenziert sowie für die Herstellung von menschlichen Gehirn-Organoiden genutzt werden. Nach umfassender Charakterisierung sollen diese Zellmodelle genutzt werden, um die Effekte erhöhter Konzentrationen von Glukokortikoiden auf die neuronale Differenzierung sowie auf die Eigenschaften humaner Neurone bzw. Gehirn-Organoide zu bestimmen. Aus Nagermodellen liegen umfangreiche Daten darüber vor, dass sowohl kurz- als auch längerfristige Expositionen gegenüber Glukokortikoiden erhebliche Auswirkungen auf die Eigenschaften (z. B. Proliferation, Vitalität und Differenzierung) sich entwickelnder neuraler Zellen haben. Damit gehen Veränderungen im Transkriptionsprofil sowie im Epigenom der murinen neuronalen Zellen einher. Nunmehr soll überprüft werden, ob im menschlichen System gleiche oder ähnliche Effekte beobachtet werden können. Diese Untersuchungen können aller Voraussicht nach Aufschluss darüber erbringen, welche Eigenschaften neuronaler (Vorläufer)Zellen (beispielsweise Vitalität, Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit, Migrationsverhalten, Morphologie und spezifische funktionale Charakteristika) durch eine kurzzeitige oder längerfristige Präsenz vergleichsweise großer Mengen an Glukokortikoiden verändert sind. Insbesondere werden Erkenntnisse darüber erwartet, ob und wenn ja welche konkreten Veränderungen im Transkriptom sich differenzierender und (terminal) differenzierter Neurone im Vergleich mit unbehandelten Zellen auftreten und ob die differentiell exprimierten Gene für Proteine/Faktoren mit Relevanz für die Differenzierung und Funktion von Neuronen codieren. Ferner soll in großer Detailtiefe überprüft werden, welche konkreten Veränderungen erhöhte Konzentrationen an Glukokortikoiden im Epigenom von hES-Zellen, von sich aus diesen differenzierenden neuronalen Zellen und von terminal differenzierten menschlichen Neuronen bewirken. Auf diesem Wege soll dazu beigetragen werden, die Ursachen der durch eine erhöhte Glukokortikoid-Konzentration bedingten langanhaltenden Veränderungen im Epigenom zu ergründen. Die erwarteten Forschungsergebnisse lassen zum einen voraussichtlich Schlussfolgerungen über die Rolle von Glukokortikoiden während neuronaler Differenzierungsprozesse im Menschen zu. Zum anderen werden Erkenntnisse darüber erwartet, welche konkreten Veränderungen in der Neurogenese und in den Eigenschaften bereits differenzierter neuronaler Zellen des Menschen durch Glukokortikoide verursacht werden. Auf dieser Grundlage könnten die molekularen Zusammenhänge zwischen einer (ggf. durch Stress bedingten) verstärkten Ausschüttung von Glukokortikoiden und Veränderungen in neuronalen Strukturen/Funktionen hergestellt werden, die auch bei der Ausprägung psychiatrischer Erkrankungen eine Rolle spielen könnten.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Effekte von Glukokortikoiden auf neurale Zellen sind in der Literatur umfangreich beschrieben worden. So hemmt beispielsweise Dexamethason die Proliferation von hippocampalen Vorläuferzellen der Ratte. Behandlung von neonatalen hippocampalen Vorläuferzell-Kulturen mit Glukokortikoiden führte zu einer deutlich erhöhten Apoptoserate in neuralen Vorläuferzellen, offenbar durch eine Erhöhung der Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies, Pertubation des mitochondrialen Membranpotentials und eine anschließende Aktivierung intrinsischer apoptotischer Signalwege. Zudem wurde auch eine Aktivierung der Ubiquitin-vermittelten Degradierung von Cyclin D1 durch Dexamethason nachgewiesen. Eine Cortison-Behandlung fötaler neuraler Vorläuferzellen aus Ratten führte in einer weiteren Studie außer zu verstärkter Apoptose auch zu einer geringeren Differenzierungsfähigkeit in neuronale und gliale Zellen sowie zu einer verminderten Synapsenbildung, was mit einer Hemmung bestimmter in die neurale Differenzierung involvierter Signalwege einherging.

Zu Effekten von Glukokortikoiden auf den Ebenen des Transkriptoms liegen ebenfalls zahlreiche Erkenntnisse aus Nagern vor. In Genexpressionsanalysen an neuronalen Vorläuferzellen wurde beispielsweise in mehreren Studien eine Vielzahl von Genen identifiziert, die infolge einer Behandlung mit Glukokortikoiden (Methylprednisolon, Dexamethason) differentiell reguliert waren. Dabei war die Expression von Genen, die für pro-apoptotische Faktoren codieren, besonders stark erhöht; veränderte Genexpressionsraten wurden auch für Gene konstatiert, deren Produkte in Zellproliferation, Zellzyklus-Regulation und (neurale) Differenzierung involviert sind. Auch Effekte von Glukokortikoiden auf das Epigenom neuraler Nager-Zellen sind bereits publiziert worden. So wurde beispielsweise eine Verminderung der globalen DNA-Methylierung nach Dexamethason-Behandlung neuraler Stammzellen beobachtet, die mit einer geringeren Präsenz von DNA-Methyltransferasen einherging. Zudem wurden nach Glukokortikoid-Exposition mehrere differentiell methylierte DNA-Regionen identifiziert und eine verstärkte Expression von Genen festgestellt, deren Produkte in die dynamische Umgestaltung des Epigenoms involviert sind. Die intrauterine Behandlung von Mausföten mit Dexamethason hatte dieselben Effekte auf das Epigenom neuraler (Vorläufer)Zellen.

Im Antragsverfahren wurden zudem zahlreiche Erkenntnisse zu den Auswirkungen von Stress auf die Ausschüttung von Glukokortikoiden, zum Einfluss von Glukokortikoiden auf die fötale und postnatale Gehirnentwicklung bei Nagern, über Effekte erhöhter Glukokortikoid-Konzentrationen auf neuronale Entwicklungsprozesse und auf morphologische Eigenschaften des Gehirns sowie in Hinblick auf Stress als maßgeblicher Risikofaktor für psychiatrische Erkrankungen dargelegt. Die den Forschungsfragen zugrundeliegende Hypothese über den Zusammenhang zwischen insbesondere vorgeburtlichem Stress, der erhöhten Ausschüttung von Glukokortikoiden, Veränderungen in der neuralen Differenzierung sowie der Ausbildung einer Prädisposition für psychiatrische Erkrankungen ist hinreichend belegt.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Verwendung menschlicher Zellen. Zwar haben tierexperimentelle Studien, die i. allg. an Nagern durchgeführt wurden, gezeigt, dass hohe Glukokortikoid-Konzentrationen im Tiermodell zu Veränderungen in der Neurogenese, im Genexpressionsprofil und Epigenom sowie zu Verhaltensanomalien führen können, jedoch können diese Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die deutlich komplexere Situation im Menschen übertragen werden. Die Größe, Struktur und Komplexität des menschlichen Neokortex sind für die kognitiven Fähigkeiten und die komplexen Verhaltensweisen des Menschen von entscheidender Bedeutung. Die Entwicklung des Zentralnervensystems, und insbesondere des Neokortex, verläuft in verschiedenen Spezies nach unterschiedlichen Mustern. Bei der Entwicklung des Neokortex des Menschen spielt beispielsweise die äußere subventrikuläre Zone, die in Nagern nicht explizit ausgeprägt ist, eine entscheidende Rolle, und es bestehen erhebliche Unterschiede in der Expansion spezifischer neuraler Vorläuferzellpopulationen, die selbst zwischen verschiedenen Primaten-Spezies stark ausgeprägt sind. Neurale Vorläuferzellen der genannten subventrikulären Zone sind aber ein mutmaßlicher Angriffspunkt für Glukokortikoide, und Erkenntnisse über die Wirkung von Glukokortikoiden auf die Gehirnentwicklung in tierischen Spezies können daher nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen werden. Zudem bestehen Unterschiede in der Organisation des Epigenoms in verschiedenen Spezies und Besonderheiten bei der epigenetischen Regulation im Menschen, so dass nicht davon auszugehen ist, dass die Mechanismen, die den Effekten der Glukokortikoid-Wirkung auf das Epigenom menschlicher Neurone zugrundeliegen, durch Untersuchungen an tierischen Zellen entschlüsselt werden können.

Die Forschungsziele können voraussichtlich auch nur unter Nutzung humaner pluripotenter Stammzellen erreicht werden. Frühe Differenzierungsprozesse, die ebenfalls Gegenstand der hier genehmigten Arbeiten sind, wurden von anderen als pluripotenten Stammzellen des Menschen wie adulten oder fötalen neuronalen Vorläuferzellen bereits durchlaufen. Untersuchungen z. B. hinsichtlich des Einflusses von Glukokortikoiden auf spätere Differenzierungsschritte oder auf die adulte Neurogenese könnten zwar theoretisch unter Nutzung fötaler oder adulter neuronaler Stammzellen erfolgen. Primäres Hirngewebe zur Gewinnung adulter neuraler Stammzellen (beispielsweise aus Autopsien) steht jedoch in der für die Klärung der Forschungsfragen benötigten Menge nicht zur Verfügung und kann nicht reproduzierbar gewonnen werden. Primäres Hirngewebe aus abgetriebenen Föten ist ebenfalls lediglich sporadisch, nicht in den für die Durchführung des Forschungs­vorhabens erforderlichen Mengen und nicht in ausreichend reproduzierbarer Qualität verfügbar. Zudem ist die Eignung adulter und fötaler Stammzellen zur Herstellung der hier erforderlichen Gehirn-Organoide nicht hinreichend belegt.

Die Forschungsziele können voraussichtlich auch nicht unter Verwendung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Die Nutzung von hiPS-Zellen ist derzeit mit zahlreichen Unwägbarkeiten verbunden. So weisen hiPS-Zellen von verschiedenen Spendern erhebliche Unterschiede in ihren genetischen Eigenschaften auf, deren Konsequenzen jeweils nicht bekannt sind. Die genetischen Eigenschaften werden – im Gegensatz zu hES-Zellen – nicht allein durch den Genotyp des Spenders, sondern auch durch das Alter des Spenders und in hohem Maße durch die Mutagenese-Historie der zur Herstellung der hiPS-Zellen verwendeten somatischen Zellen bestimmt. Insbesondere Fibroblasten, die häufig zur Herstellung von hiPS-Zellen genutzt werden, akkumulieren aufgrund der Umweltexposition der Haut Mutationen in erheblichem Maße. Weitere offene Fragen zur genetischen Integrität von hiPS-Zellen können sich auch aus reprogrammierungsbedingter De-novo-Mutagenese ergeben. Dabei verursachen unter­schiedliche Reprogrammierungsmethoden gleichermaßen karyotypische Anomalien und Mutationen, und der Reprogrammierungsprozess scheint per se genomische Veränderungen zu begünstigen. Auch die epigenetische Integrität von hiPS-Zellen ist derzeit unsicher, und es bestehen weiterhin deutliche Hinweise darauf, dass sich hiPS-Zellen hierin von hES-Zellen unterscheiden. Ferner gibt es starke Anhaltspunkte für das Fortbestehen epigenetischer Eigenschaften der zur Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen in hiPS-Zellen (sog. epigenetisches Gedächtnis), dessen funktionelle Bedeutung derzeit nicht vollständig geklärt ist, das aber bei der neuronalen Differenzierung von hiPS-Zellen von Relevanz sein kann. Da sich die geplanten Forschungsarbeiten jedoch in starkem Maße auch auf die Effekte von Glukokortikoiden auf das Epigenom beziehen, ist die Integrität des Epigenoms der verwendeten Zellen zwingend erforderlich.

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