126. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Planck-Gesellschaft (Max-Planck-Institut für molekulare Biomedizin, Münster)

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HUES 2 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• HUES 6 (Harvard University, Cambridge, MA, USA)
• NCL-3 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritannien)
• NCL-4 (Newcastle Fertility Centre, Newcastle upon Tyne, Großbritannien)
• Shef 3 (University Sheffield, Sheffield, Großbritannien)

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Etablierung und Optimierung von Vorgehensweisen für die Gewinnung männlicher Keimzellen des Menschen aus pluripotenten Stammzellen. Das Forschungsvorhaben gliedert sich in vier Projektteile. In einem ersten Vorhabensteil sollen zunächst zahlreiche Reporter- und weitere gentechnisch veränderte hES-Zell-Linien etabliert und charakterisiert werden, mit denen zum einen die Vorgehensweisen für die Differenzierung in Keimzellen optimiert und zum anderen die Funktionen der entsprechenden Genprodukte für Prozesse der Keimzelldifferenzierung bestimmt werden sollen. In einem zweiten Teilprojekt sollen Wildtyp- oder genetisch veränderte hES-Zellen in indifferente, zu primordialen Keimzellen ähnliche Zellen (premordial germ cell like cells, PGCLC) differenziert und anschließend einer (xenogenen) Nagetier-Hodenumgebung ausgesetzt werden, in der eine Organoidbildung und die weitere Differenzierung der PGCLC in Richtung männlicher Keimzellen erwartet wird. In einem dritten Projektteil sollen Vorgehensweisen für die direkte Differenzierung von hES-Zellen in spermatogoniale Stammzellen (SSC) etabliert und optimiert werden, insbesondere durch ektopische Überexpression von für die Spermatogenese kritischen Transkriptionsfaktoren. Mutmaßliche SSC (bzw. deren Vorläufer) sollen zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung isoliert, angereichert, umfassend charakterisiert und schließlich zur weiteren Reifung in Hoden-Organoide eingebracht werden. In einem vierten Projektteil soll schließlich ein für den Menschen allogenes Organoid-Modell zur Untersuchung der Entwicklung männlicher Keimzellen etabliert werden. Dazu sollen aus hES-Zellen zunächst Reporter-Zell-Linien hergestellt werden, in denen die Expression des Reportergens unter Kontrolle der Promotoren von Genen steht, deren Produkte insbesondere bei der Differenzierung von Zellen des intermediären Mesoderms in Sertoli-und Leydig-Zellen eine erhebliche Rolle spielen. Diese Reporterzell-Linien sollen in Richtung Gonadenzellen differenziert, die dafür erforderlichen Vorgehensweisen optimiert und die entstehenden Gonadenzellen mit sich entwickelnden PGCLC kultiviert werden. Die weitere Keimzellentwicklung in diesem Organoid-Modell soll dann durch umfassende Analyse der Zellen überprüft werden. Alle Arbeiten werden im Vergleich zwischen hES-Zellen und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) durchgeführt.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung, die langfristig ggf. auch für die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung beim Menschen von Relevanz sein können. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Das Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten besteht in der Entwicklung von Vorgehensweisen für die Erzeugung männlicher Keimzellen aus pluripotenten Stammzellen. Die in diesem Zusammenhang geplanten Untersuchungen sollen zudem zur Identifizierung von Faktoren und Signalkaskaden führen, die in verschiedenen Phasen der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen des Menschen in Richtung männlicher Keimzellen von Relevanz sind. Dabei sollen der Einfluss von Wachstumsfaktoren sowie von artifiziellen Gewebenischen auf diese Differenzierungsprozesse aufgeklärt werden.

Die molekularen Mechanismen, die der Spezifizierung primordialer Keimzellen des Menschen in männliche Keimzellen zugrunde liegen, sind bislang unzureichend verstanden. Jüngere Studien haben gezeigt, dass die geschlechtsspezifische Differenzierung von Keimzellen ein Prozess ist, der erst nach dem Durchlaufen des (offenbar indifferenten) Stadiums der primordialen Keimzellen einsetzt, deren Epigenom über einen relativ langen Zeitraum überraschend stabil ist und deren Transkriptom Merkmale sowohl von pluripotenten Stammzellen als auch von Keimzellen aufweist. Im Forschungsvorhaben soll geklärt werden, wie diese indifferenten Keimzellen in Richtung geschlechtsspezifischer männlicher Keimzellen differenziert werden können.

Durch Nutzung verschiedener transgener hES-Zell-Linien (beispielsweise Reporter-Zell-Linien oder hES-Zellen, in denen die Gene für bestimmte Transkriptionsfaktoren überexprimiert oder ausgeschaltet werden) lassen sich zwei Fragestellungen klären: Erstens kann mittels Reporter-Zell-Linien bestimmt werden, ob die Zugabe extrinsischer Faktoren zu veränderten Genaktivitäten führt, die mit der Keimzelldifferenzierung in Zusammenhang stehen, was zu Einblicken in für die Keimzellentwicklung relevante Signalkaskaden sowie zu verbesserten Vorgehensweisen für die In-vitro-Differenzierung von männlichen Keimzellen führen kann. Zweitens lassen sich ggf. Schlüsse auf die Funktion bestimmter Genprodukte in spezifischen Phasen der Keimzelldifferenzierung ziehen, wodurch das Verständnis der Prozesse, die bei der Entwicklung männlicher Keimzellen des Menschen ablaufen, vertieft werden kann.

Durch die beabsichtigte Untersuchung des Einflusses der zellulären Umgebung des sich entwickelnden Hodens auf die Differenzierung männlicher Keimzellen im Rahmen von artifiziellen Hoden-Organoiden sollen sowohl der Einfluss einer xenogenen als auch einer allogenen Nische auf die weitere Differenzierung der Keimzellen bestimmt werden. Dabei sollen Erkenntnisse darüber erlangt werden, welche Prozesse der Entwicklung männlicher Keimzellen von der Präsenz von Zellen eines sich entwickelnden somatischen Hodengewebes abhängig sind und ob die xenogene Nische hinreichend ist, die Prozesse der menschlichen Keimzellentwicklung zu steuern. Die geplante Untersuchung der Effekte einer (aus hES-Zellen abgeleiteten) humanen somatischen Nische (insbesondere von Sertoli- und Leydig-Zellen) soll u. a. klären helfen, ob ggf. erforderliche humanspezifische Faktoren für die Entwicklung männlicher Keimzellen des Menschen erforderlich sind; entsprechende Faktoren sollen ggf. identifiziert und charakterisiert werden. Zudem sollen in diesem Projektteil auch (bislang nicht verfügbare) Vorgehensweisen für die Gewinnung somatischer menschlicher Hodenzellen aus pluripotenten Stammzellen entwickelt werden, was voraussichtlich mit einem Erkenntnisgewinn über die hieran beteiligten Moleküle und Signalwege einhergeht.

Über den möglichen Erkenntnisgewinn über zell- und molekularbiologische Grundlagen der Keimzellentwicklung hinaus können die im Forschungsvorhaben angestrebten Erkenntnisse ggf. auch zum Verständnis über die Ursachen männlicher Infertilität beitragen. Die im Forschungsvorhaben entwickelten Vorgehensweisen könnten zudem  – bei Übertragung auf patientenspezifische hiPS-Zellen – zur Schaffung von Grundlagen für die langfristig vorstellbare Behandlung männlicher Infertilität führen. Ferner kann die Entschlüsselung der Rolle von spezifischen Faktoren und Bedingungen der Keimzellentwicklung auch zur Identifizierung neuer targets für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung männlicher Infertilität beitragen. In diesem Zusammenhang ist auch das Forschungsziel, das Keimzellentwicklungspotential von hES- und hiPS-Zellen vergleichend zu bewerten, von großer Relevanz.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Arbeiten zur Differenzierung pluripotenter Stammzellen der Maus zu männlichen Keimzellen sind in der wissenschaftlichen Literatur vielfach publiziert worden. Bereits vor mehr als 10 Jahren wurden Ergebnisse zur Etablierung spermatogonialer Stammzell-Linien aus murinen ES-Zellen veröffentlicht; die Transplantation von aus den SSC abgeleiteten Zellen in Maushoden führte zur Bildung funktionsfähiger Keimzellen, die zur Erzeugung lebensfähigen Nachwuchses genutzt werden konnten. Ein schrittweises Vorgehen für die Spezifizierung pluripotenter muriner Stammzellen zu PGCLC und für deren Gewinnung in größeren Mengen, die auf zahlreichen und detaillierten Studien zur Sequenz molekularer Ereignisse während der Keimzellentwicklung bei der Maus beruhten, wurden bereits vor mehr als fünf Jahren publiziert. Die Tatsache, dass die Aggregation von murinen PGC mit somatischen Zellen aus Mäusehoden zur Rekonstitution einer hodenähnlichen Nische führt, in der sich nach Transplantation unter die Nierenkapsel die Reifung der aggregierten PGC zu funktionsfähigen Spermien vollziehen kann, wurde ebenfalls vor bereits mehreren Jahren belegt. Die definierte In-vitro-Entwicklung von murinen PGCLC zu SSC durch Aggregation mit somatischen Gonadenzellen wurde kürzlich in der Literatur beschrieben. Zur etwa selben Zeit wurde ein definiertes Vorgehen zur reinen In-vitro-Herstellung befruchtungsfähiger männlicher Gameten aus Maus-ES-Zellen publiziert, wobei gleichfalls eine Kultivierung der Keimzell-Vorläufer mit Zellen aus neonatalen Maushoden erfolgte. Die molekularen Eigenschaften von murinen somatischen Gonadenzellen und deren Vorläufern, auf deren Grundlage die Differenzierung von hES-Zellen in entsprechende menschliche Zellen erfolgen soll, sind ebenfalls bekannt. Auch für das humane System liegen bereits umfangreiche Daten zur Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in Richtung von Keimzellen vor. Humane PGC können grundsätzlich in vitro aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen werden. Jüngere Studien haben zudem gezeigt, dass humane PGC sich aus einer intermediären mesodermalen Zellpopulation ableiten. Die Möglichkeit einer In-vitro-Herstellung humaner testikularer Organoide aus somatischen Gonadenzellen wurde ebenfalls bereits nachgewiesen.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Verwendung menschlicher Zellen. Zwar wurden die grundsätzlichen molekularen Prozesse während der Bildung von Keimzellen bei Säugern am Mausmodell beschrieben; allerdings bestehen erhebliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch in der Transkriptionsregulation bei der Differenzierung pluripotenter Stammzellen zu Keimzellen, beispielsweise hinsichtlich der Expression der Gene für PRDM14 und SOX2; spezifische Fragen der Keimzelldifferenzierung beim Menschen können folglich aller Voraussicht nach nicht in nicht-humanen Modellsystemen geklärt werden. Da ein wesentliches Ziel des Forschungsvorhabens in der Aufdeckung der frühesten molekularen Ereignisse während der Entstehung männlicher Gameten ist, können auch somatische Stammzellen nicht zur Erreichung der Forschungsziele genutzt werden.  Klinisches Primärmaterial zur Gewinnung von PGCs existiert nicht. Eine Gewinnung von Keimzell-Vorläuferzellen aus humanen Föten, die in der 6. bis 8. Schwangerschaftswoche abgetrieben werden, ist zwar möglich; jedoch lassen sich aus solchem Material nicht Zellen in für die Durchführung des Forschungsvorhabens ausreichender Menge und reproduzierbarer Qualität gewinnen. Zudem erfordert die Erreichung der Forschungsziele umfangreiche genetische Modifikationen an den Ausgangszellen, denen aus abgetriebenen Föten gewonnene Keimzell-Vorläuferzellen schwer zugänglich sind.

Auch durch alleinige Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) lassen sich die Forschungsziele nach gegenwärtigem Kenntnisstand voraussichtlich nicht erreichen. hiPS-Zellen haben je nach ihrem Ursprung einen unbestimmten genetischen Hintergrund und weisen aus diesem Grunde eine erhebliche Variabilität auf. Die Frage, ob und inwieweit sich hiPS-Zellen für die Differenzierung in männliche Keimzellen eignen, ist für diese Zellen bislang ebenso wenig geklärt wie für hES-Zellen. Es besteht die begründete Annahme, dass hES-Zellen auf Grund ihres gegenüber hiPS-Zellen ursprünglicheren Epigenoms eine ggf. bessere Keimzell-Differenzierungskapazität aufweisen als hiPS-Zellen. Epigenetische Unterschiede zwischen hiPS- und hES-Zellen, die beispielsweise auf eine unvollständige Reprogrammierung rückführbar sind, wurden vielfach beobachtet. Zudem stellt die reprogrammierungsbedingte De-novo-Mutagenese ein in hiPS-Zellen beobachtetes Phänomen dar, dessen Auswirkungen auf Differenzierungsprozesse nicht vorhersagbar sind. Hinzu kommen mögliche Effekte, die mit der hohen Variabilität in den Eigenschaften von verschiedenen hiPS-Zell-Linien zusammenhängen könnten, die wiederum durch den jeweils unterschiedlichen genetischen Hintergrund oder das Alter des Spenders sowie durch den für die Reprogrammierung benutzten Zelltyp oder die für die Reprogrammierung gewählte Methode verursacht werden können. Ferner ist es explizites Ziel des Forschungsvorhabens, das Potential von hES- und hiPS-Zellen zur Differenzierung in Richtung männlicher Keimzellen vergleichend zu bewerten, was die Nutzung von hES-Zellen selbstverständlich erforderlich macht.

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