130. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Universitätsklinikum Essen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• I3 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• KhES-1 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
• KhES-2 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
• KhES-3 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan

Die Genehmigung gilt auch für die Verwendung von Sub-Linien (z.B. von klonalen Sub-Linien oder genetisch modifizierten Derivaten) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen hES-Zellen für die Differenzierung in Stamm- und Vorläuferzellen des Cornea-Epithels sowie des retinalen Pigmentepithels und in aus diesen abgeleitete somatische Zellen verwendet werden. Dabei sollen Gene für Transkriptionsfaktoren, die in die jeweiligen Differenzierungsvorgänge (mutmaßlich) involviert sind, in hES-Zellen eingebracht und ektopisch exprimiert oder aber die Expression dieser Gene in hES-Zellen vermindert bzw. ausgeschaltet werden. Durch vergleichende Differenzierung von genetisch veränderten und Wildtyp-Zellen und anschließende umfangreiche morphologische, immunhistochemische und molekulare Analyse der differenzierten Zellen sollen Rückschlüsse auf die Funktion der jeweils veränderten Gene im Differenzierungsprozess gezogen werden. Durch Analysen der Transkriptome sollen dann weitere Gene identifiziert werden, deren Aktivität infolge der genetischen Modifikationen verändert ist und die ggf. in Differenzierungsprozesse in Richtung retinaler und cornealer Zellen involviert sind. Solche Gene sollen dann in hES-Zellen ebenfalls ektopisch exprimiert bzw. ausgeschaltet und die Effekte auf die Differenzierung bestimmt werden. Darüber hinaus sollen intrazelluläre Prozesse (beispielswiese Signaltransduktionswege) identifiziert werden, an denen die Produkte solcher Gene (mutmaßlich) beteiligt sind und überprüft werden, ob die Modulation dieser Prozesse (z. B. durch Wachstumsfaktoren, sog. kleine Moleküle etc.) ggf. zu einem veränderten Differenzierungsverhalten führt.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Entsprechend der im Antragsverfahren erbrachten wissenschaftlich begründeten Darlegung dienen die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen in der Grundlagenforschung, wobei auch Grundlagen für die Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren zur Anwendung bei Menschen geschaffen werden können. Für diese Beurteilung sind folgende Gründe maßgeblich:

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist es, ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen der Differenzierung in Zellen des Cornea-Epithels bzw. des retinalen Pigmentepithels (RPE) zu erlangen. Gleichzeitig sollen die Vorgehensweisen für die Gewinnung möglichst reiner Populationen an Stamm- bzw. somatischen Zellen des Cornea-Epithels sowie des RPE verbessert werden.

Verletzungen bzw. Degeneration des Cornea-Epithels sowie Degeneration des RPE sind derzeit schwer oder nicht therapierbar. Im Falle der Cornea stellt die  Transplantation von Stammzellen des Cornea-Epithels vom gesunden in  das erkrankte/verletzte Auge eine Therapiemöglichkeit dar, die jedoch bei beidseitiger Verletzung der Cornea sowie bei älteren Patienten, in denen die entsprechenden Stammzellen eine verringerte  Proliferationskapazität haben, nicht genutzt werden kann. Die Gewinnung von (Stamm)Zellen der Cornea und des RPE aus pluripotenten Stammzellen sowie, damit in Zusammenhang stehend, die Aufdeckung der den Differenzierungsprozessen zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind daher von erheblichem Interesse.

Die Differenzierung von hES-Zellen in (Stamm)Zellen des Cornea-Epithels wurde in der Vergangenheit in einigen Studien beschrieben. Obwohl dabei teils gute Ausbeuten an Zellen erreicht wurden, die bestimmte Marker cornealer Epithelzellen aufwiesen, wurden die den Differenzierungsvorgängen zugrundeliegenden molekularen Prozesse und Veränderungen bislang wenig untersucht. Hier soll nun die Funktion einzelner Transkriptionsfaktoren detailliert bestimmt werden, die in die Differenzierung pluripotenter Stammzellen in (Vorläufer)Zellen des Cornea-Epithels involviert sind. Dies kann voraussichtlich dazu beitragen, die Erforderlichkeit der Präsenz der jeweiligen Transkriptionsfaktoren während bestimmter Phasen der cornealen Differenzierung bewerten zu können. Ferner soll die Aufklärung von Signaltransduktionswegen oder anderer zellulärer Prozesse ermöglicht werden, die während spezifischer Phasen der cornealen Differenzierung ablaufen. Dies ist sowohl von Relevanz für ein tieferes Verständnis der molekularen Prozesse, die während der Entstehung des Cornea-Epithels im sich  entwickelnden Menschen ablaufen, als auch für die Optimierung entsprechender In-vitro-Differenzierungsprotokolle. Letzteres soll durch die geplante exogene Modulation von differenzierungsrelevanten Signalwegen durch Wachstumsfaktoren bzw. kleine Moleküle erfolgen, was auch zu Erkenntnissen darüber beitragen kann, wie beispielsweise das Regenerationsvermögen cornealer epithelialer Zellen durch kleine Moleküle verbessert werden kann.

Die molekularen Vorgänge und Signaltransduktionswege, die der RPE-Differenzierung zugrundeliegen, sind im wesentlichen bekannt. Jedoch sind viele Fragen nach der spezifischen Funktion der Produkte bestimmter Gene im Differenzierungsprozess ungeklärt. Das im Forschungsvorhaben angestrebte Vorgehen, mit dem die Expression dieser und anderer Gene moduliert, die Effekte der Genaktivitätsmodulation in verschiedenen Phasen der RPE-Zell-Differenzierung überprüft und letztlich Zielgene der entsprechenden Genprodukte identifiziert und bezüglich ihrer Funktion in der RPE-Zell-Differenzierung näher untersucht werden sollen, soll zu einem verbesserten Verständnis der entsprechenden Differenzierungsprozesse während der menschlichen Embryonalentwicklung beitragen und ist daher von entwicklungsbiologischer Relevanz. Zudem können die angestrebte Identifizierung von Signaltransduktionswegen, an denen die entsprechenden Genprodukte beteiligt sind, sowie Erkenntnisse aus der exogenen Modulation dieser Signalwege während der RPE-Zell-Differenzierung ebenfalls zu neuen Erkenntnissen über molekulare Grundlagen der Differenzierung von RPE führen und zur Schaffung von Grundlagen für die Erarbeitung verbesserter Differenzierungsprotokolle beitragen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Im Antrag sind verschiedene Gene benannt, deren Bedeutung für die Differenzierung von hES-Zellen zu Zellen des Cornea-Epithels bzw. zu RPE-Zellen detailliert untersucht werden soll. Dabei wurde umfassend dargelegt, dass die in Blick genommenen Gene für die Entwicklung der Cornea bzw. der Retina essentiell sind. Die Bedeutung der jeweiligen Gene für die Bildung bestimmter Strukturen des Auges wurde in entsprechenden Mutations- bzw. knock out-Tiermodellen bereits umfassend untersucht. So führen beispielsweise (heterozygote) Mutationen im Pax6-Gen in der Maus zu einer pathologisch veränderten Cornea, und das Lhx2-Gen ist für die Homöostase des Cornea-Epithels essentiell. Deletionen von Otx-Genen bewirkten den Verlust des retinalen Pigmentepithels, während Mutationen im Mitf-Gens den funktionalen Verlust des RPE in der Maus bedingten. Für die Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen wurde die sequentielle Expression der Gene für bestimmte Transkriptionsfaktoren mit Relevanz für die Entwicklung des RPE bereits gezeigt. Protokolle für die Gewinnung von Zellen des Cornea-Epithels sowie des RPE wurden in der wissenschaftlichen Literatur publiziert und sollen als Grundlage für das experimentelle Vorgehen dienen. Effektive Vorgehensweisen für die genetische Modifikation von hES-Zellen sind vielfach publiziert worden und sind beim Genehmigungsinhaber, der auch über weitere Genehmigungen zur Verwendung von hES-Zellen verfügt, etabliert. Die Vorgehensweisen für die Charakterisierung der differenzierten Zellen sind ebenfalls etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Erreichung der Forschungsziele erfordert die Verwendung menschlicher Zellen. Es wurde umfassend dargelegt, dass erhebliche Unterschiede in der Morphologie, Funktionsweise und Entwicklung der Augen verschiedener Spezies bestehen, beispielsweise in Hinblick auf die Schichtung  und Verteilung der von Vorläuferzellen innerhalb der Cornea. Zudem bestehen erhebliche Unterschiede im Proliferationsvermögen des cornealen Pigmentepithels verschiedener Spezies, was auf wesentliche Unterschiede in den molekularen Prozessen der Differenzierung von Cornea und RPE schließen lässt. Da die Arbeiten letztlich zur Schaffung von Grundlagen für verbesserte Protokolle zur Gewinnung humanen Zellmaterials beitragen sollen, ist die Nutzung menschlicher Zellen als Ausgangsmaterial erforderlich.

Die Forschungsziele können voraussichtlich ferner nur unter Nutzung humaner pluripotenter Stammzellen erreicht werden. Da frühe Differenzierungsprozesse (beispielsweise die Prozesse bei der Entstehung von Zellen des Augenfeldes sowie die Entstehung cornealer bzw. retinaler Stammzellen) untersucht werden sollen, können fötale und adulte Stammzellen des Auges nicht genutzt werden, da diese Zellen die dabei interessierenden Differenzierungsprozesse bereits durchlaufen haben. Zwar könnten Stammzellen des Cornea-Epithels und des RPE aus postmortalem Patientenmaterial gewonnen und theoretisch für die Untersuchung späterer Differenzierungsschritte genutzt werden; jedoch ist eine Gewinnung solcher Zellen in für die Projektdurchführung ausreichenden Mengen und in ausreichend reproduzierbarer Qualität derzeit nicht möglich.

Nach gegenwärtigem Kenntnisstand liegen auch keine ausreichenden Hinweise darauf vor, dass sich die Forschungsziele unter Nutzung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen) erreichen ließen. Da die Rolle spezifischer Genprodukte bei der Differenzierung in epitheliale Zellen der Cornea und  der Retina durch die gezielte genetische Veränderung der entsprechenden Gene ermittelt werden soll, müssen die Effekte der jeweiligen genetischen Veränderung möglichst eng eingegrenzt werden. Dies erfordert zum einen Zellen, deren Differenzierbarkeit in Zellen des Cornea-Epithels und des RPE gut belegt ist. Zum anderen sind (in genetischer Hinsicht) möglichst ursprüngliche Zellen erforderlich. Diese Forderung erfüllen derzeit nur hES-Zellen. Zwar lassen sich auch hiPS-Zellen in Zellen des Cornea-Epithels sowie des RPE differenzieren; jedoch bestehen bei Nutzung von hiPS-Zellen verschiedene Unwägbarkeiten, die vor allem mit der hohen Variabilität und den genetischen Eigenschaften von verschiedenen hiPS-Zellen in Zusammenhang stehen. hiPS-Zellen haben aufgrund ihrer Ableitung aus somatischen Zellen bereits diverse Mutationen angereichert; hinzukommen Mutationen, die durch den Reprogrammierungsprozess offenbar regelmäßig erworben werden. Es ist derzeit nicht bekannt, ob und inwieweit solche Mutationen die Differenzierungsfähigkeit der Zellen beeinflussen. Ferner gibt es weiterhin starke Anhaltspunkte für das Fortbestehen epigenetischer Eigenschaften der zur Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen in hiPS-Zellen (sog. epigenetisches Gedächtnis), dessen funktionelle Konsequenzen derzeit nicht vollständig geklärt ist, das aber bei der Differenzierung von hiPS-Zellen von erheblicher Relevanz sein kann.

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