137. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Universitätsklinikum Essen

2. Zell-Linien

Die vorgesehenen Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H7 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• HES-3 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• HES-4 (ES Cell International Pte Ltd, Singapur)
• I3 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I4 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• I6 (Technion - Israel Institute of Technology, Haifa, Israel)
• KhES-1 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
• KhES-2 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan)
• KhES-3 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, Japan

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. für klonale Sub-Linien oder genetisch modifizierte Derivate) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Das Forschungsvorhaben ist Teil einer Gruppe von Projekten am Universitätsklinikum Essen, in denen molekulare Ursachen von syndromalen Erkrankungen des Menschen aufgeklärt werden sollen, die mit Intelligenzminderung einhergehen.

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen mögliche molekulare Ursachen für Intelligenzminderung untersucht werden, die mit genetischen Veränderungen auf X-chromosomal kodierten Genen assoziiert sind. Entsprechende Gene sollen in hES-Zellen mutiert bzw. in ihrer Expression moduliert, die mutierten hES-Zellen dann in den naiven Zustand der Pluripotenz überführt und in Richtung neuraler Zellen differenziert werden. Dabei soll der Einfluss der jeweiligen Mutationen/Expressionsveränderungen auf die X-Chromosom-Inaktivierung und die neurale Differenzierung ermittelt, das Spektrum und die Eigenschaften der neuronalen Zellen bestimmt und, da die Produkte der hier interessierenden Gene auch in Spleiß-Vorgänge involviert sind, insbesondere Spleiß-Varianten bestimmter RNAs in verschiedenen Phasen der neuralen Differenzierung bestimmt werden. Sollten Gene identifiziert werden, deren Expression gegenüber Wildtyp-Zellen verändert sind, so soll der Einfluss von deren Produkten auf die neuronale Differenzierung bestimmt werden, beispielsweise durch Mutation der entsprechenden Gene in hES-Zellen und anschließende neuronale Differenzierung.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung.

Gegenstand des Forschungsvorhabens ist die Untersuchung möglicher funktionaler Ursachen von X-chromosomal assoziierten Intelligenzminderungssyndromen. Der Schwerpunkt der Arbeiten liegt dabei auf der Untersuchung von Mutationen in den X-chromosomalen Genen IQSEC2 und RBMX, deren Auswirkungen auf die Entwicklung humaner Neuronen bislang nur unzureichend untersucht wurden. Mutationen im IQSEC2-Gen führen sowohl bei Männern als auch bei Frauen zu Intelligenzminderung und epileptischen Enzephalopathien, obwohl IQSEC2 nicht der X-Inaktivierung unterliegt. Es ist bekannt, dass IQSEC2 für drei verschiedene Isoformen kodiert. Beim Shashi-Syndrom ist die Ausprägung der Intelligenzminderung sehr variabel, so dass ein Modifier-Effekt vermutet wird, bei dem RBMXL1, eine aktive Retrokopie von RBMX auf Chromosom 1, als Modifier-Gen fungieren könnte. RBMX und RBMXL1 kodieren für Proteine, die Teil des Spleiß-Komplexes sind und somit durch eine veränderte Zusammensetzung dieses Komplexes die Genexpression indirekt beeinflussen könnten.

Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen die relevanten krankheitsassoziierten Gene IQSEC2, RBMX und RBMXL1 funktional ausgeschaltet, patientenspezifisch mutiert oder hinsichtlich ihrer Expressionsstärke verändert werden. Um eine X-Inaktivierung in vitro nachvollziehen zu können, sollen die hES-Zellen dann zunächst in den naiven Zustand überführt und anschließend in neurale Zellen/kortikale Organoide differenziert werden. Anschließend sollen die aus weiblichen und männlichen (naiven) hES-Zellen abgeleiteten neuronalen (Vorläufer)Zellen bzw. die kortikalen Organoide umfassend analysiert werden, wobei u. a. das Differenzierungsverhalten von Stamm- und Vorläuferzellen untersucht sowie Analysen der Morphologie, des Genexpressionsmusters, des Proteoms und der elektrischen Aktivität der neuronalen Zellen durchgeführt werden sollen.

Ziel der Forschungsarbeiten ist u. a. die Klärung der Frage, welche Effekte Mutationen in den verschiedenen Isoformen von IQSEC2 haben, ob es funktionelle und phänotypische Unterschiede zwischen Missense-Mutation und trunkierenden Mutationen in IQSEC2 gibt, ob und in welchem Maße die X-Inaktivierung die Effekte der IQSEC2-Mutationen beeinflussen könnte, welchen Effekt additive Mutationen in RBMX und RBMXL1 auf die neuronale Entwicklung haben und inwieweit geschlechtsspezifische Unterschiede bezüglich der Effekte von Mutationen in IQSEC2 und RBMXL1 vorliegen. Die Forschungsarbeiten sollen dazu beitragen, die molekularen Funktionen der Produkte der genannten Gene besser als bislang zu verstehen. Beispielsweise liegen Hinweise darauf vor, dass IQSEC2 eine essentielle Funktion bei der Aufrechterhaltung der synaptischen Plastizität und bei der Kommunikation zwischen Neuronen hat: Mutationsträgerinnen weisen hier einen (pathologischen) Phänotyp auf, obwohl IQSEC2 nicht der X-Inaktivierung unterliegt und die zweite (normale) Kopie des Gens zur Kompensation aktiv ist. Aus den Forschungsarbeiten sind daher Erkenntnisse über die besondere Rolle von IQSEC2 in der neuronalen Signalverarbeitung zu erwarten. Insgesamt soll das Verständnis von molekularen Ursachen X-chromosomal-assoziierter Intelligenzminderungen vertieft werden, insbesondere bei Erkrankungen, die sich in beiden Geschlechtern manifestieren, und bei Erkrankungen, denen ggf. Modifier-Effekte als Ursache der phänotypischen Diversität zugrunde liegen. Die Identifikation von Zielgenen bzw. Signalwegen, deren Aktivität durch die Produkte der o. g. Gene moduliert wird, kann zudem zur Entdeckung neuer Zielstrukturen für pharmakologische Interventionen beitragen, die Grundlage für die Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung dieser Erkrankungen sein kann.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten ausreichend vorgeklärt ist.

Die Assoziation von Mutationen in den Genen IQSEC2 und RBMX mit X-chromosomal bedingter Intelligenzminderung wurde 2010 im Ergebnis von Hochdurchsatz-Sequenzierungsstudien beschrieben und im folgenden mehrfach bestätigt. Das Produkt des IQSEC2-Gens ist in den Dendriten post-synaptischer exzitatorischer Neurone lokalisiert und spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulation der synaptischen Signalübertragung. Das Produkt des RBMX-Gens wurde als ein RNA-bindendes Protein beschrieben, das an Spleiß-Prozessen beteiligt ist. Darüber hinaus ist es offenbar an DNA-Reparaturprozessen beteiligt und übt verschiedene zelluläre Funktionen aus, u. a. bei der Neurogenese. Erst kürzlich wurde es als mögliche genetische Ursache einer X-chromosomal vererbten Intelligenzminderung beim Menschen beschrieben. Es wird vermutet, dass eine aktive Retrokopie des RBMX-Gens (RBMXL1), dessen Produkt ebenfalls Teil des Spleiß-Komplexes ist, die Effekte von RBMX moduliert.

Protokolle für die Gewinnung von neuronalen (Vorläufer)Zellen und Gehirn-Organoiden wurden in der wissenschaftlichen Literatur publiziert und sind beim Genehmigungsinhaber bereits teilweise etabliert. Effektive Vorgehensweisen für die genetische Modifikation von hES-Zellen, beispielsweise unter Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie, sind vielfach publiziert worden. Die Vorgehensweisen für die Charakterisierung der differenzierten neuronalen Zellen sind ebenfalls etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die Notwendigkeit der Verwendung humaner Zellen zur Erreichung der Forschungsziele ergibt sich aus der Spezies-Spezifität von Prozessen der neuralen Differenzierung und humanspezifischen neurologischen und mentalen Veränderungen, die bei den hier interessierenden Syndromen auftreten. Die Studien können insbesondere nicht in der Maus durchgeführt werden, da das hier interessierende Gen IQSEC2 in der Maus, im Gegensatz zum Menschen, der X-Inaktivierung unterliegt. Ebenso ist die für die Forschungsfrage relevante Retrokopie des RBMX-Gens, RBMXL1, bei der Maus nicht vorhanden. Die hier geplanten Untersuchungen zur Klärung der pathophysiologischen Mechanismen der X-chromosomal bedingten mentalen Retardierung beim Menschen erfordern daher die Verwendung menschlicher Zellen.

Die Notwendigkeit der Verwendung humaner pluripotenter Stammzellen ergibt sich aus der Tatsache, dass andere in Frage kommende Stammzellen des Menschen (neurale Stammzellen aus abgetrieben Föten, neurale Zellen aus Autopsiematerial etc.) nicht in der für die Projektdurchführung erforderlichen Menge und in reproduzierbarer Qualität verfügbar sind. Zudem haben solche Zellen die (hier interessierenden) Prozesse der Inaktivierung des X-Chromosoms und der frühen neuronalen Entwicklung bereits durchlaufen und sind einer genetischen Veränderung und der Etablierung stabil veränderter (nicht-immortalisierter) Zell-Linien nicht im selben Maße zugänglich wie pluripotente Stammzellen. Zudem gibt es derzeit keine Hinweise darauf, dass die für die Klärung der Forschungsfragen erforderlichen zerebralen Organoide aus anderen als humanen pluripotenten Stammzellen gewonnen werden könnten.

Nach derzeitigem Kenntnisstand können die Forschungsziele auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Da Effekte von krankheitsauslösenden Mutationen auf das neurale Differenzierungspotential untersucht werden sollen, sind Zellen erforderlich, die möglichst ursprüngliche Charakteristika aufweisen. hiPS-Zellen können jedoch Mutationen enthalten, die bereits in den zur Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen vorhanden sind. Zudem sind Fragen nach der Aktivität des X-Chromosoms für viele hES-Zellen detailliert untersucht worden, während für hiPS-Zellen zu dieser Frage widersprüchliche Resultate vorliegen. Fraglich ist zudem, ob und inwieweit bei der Reprogrammierung somatischer Zellen zu hiPS-Zellen auch eine Reaktivierung der X-Chromosomen erfolgt.

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