141. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber

Dr. Moritz Mall, Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), Heidelberg

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)
• H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. für klonale Sub-Linien oder genetisch modifizierte Derivate) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Die Forschungsarbeiten erfolgen vor dem Hintergrund, dass die Zellidentität offenbar nicht dauerhaft festgelegt ist, sondern durch die stete Repression alternativer Entwicklungsprogramme durch spezifische Transkriptionsfaktoren aktiv aufrechterhalten werden muss. Da in neuronalen Zellen der Maus die Aufrechterhaltung der Zellidentität wesentlich durch den Transkriptionsfaktor Myt1l reguliert wird, soll nunmehr die Rolle dieses Transkriptions-Repressors sowie verwandter Faktoren für die Entstehung und Aufrechterhaltung der Identität neuronaler Zellen des Menschen, die aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnen werden, untersucht werden. Dafür werden hES-Zellen genetisch zunächst so verändert werden, dass sie spezifische Mutationen im MYT1L-Gen aufweisen. Anschließend werden die hES-Zellen nach verschiedenen Methoden in Neurone bzw. neuronale Organoide differenziert und umfassend auf für humane neuronale Zellen wesentliche Eigenschaften hin untersucht. Anschließend sollen, durch Vergleich des Expressionsprofils von bezüglich des MYT1L-Gens ursprünglichen und genetisch veränderten neuronalen Zellen, Zielgene von MYT1L identifiziert, seine Wechselwirkungspartner ermittelt und insbesondere epigenetische Veränderungen infolge einer veränderten bzw. fehlenden MYT1L-Genexpression bestimmt werden. Dabei soll insbesondere überprüft werden, ob und wenn ja welche weiteren Faktoren mit Relevanz für die epigenetische Integrität der Zellen von MYT1L als Kofaktoren rekrutiert werden. Die Gene für Faktoren, die durch MYT1L reguliert werden oder mit ihm in Wechselwirkung stehen, sollen dann in hES-Zellen funktional ausgeschaltet oder überexprimiert werden und der Effekt auf die Eigenschaften der aus diesen Zellen differenzierten Neurone im Detail untersucht werden. Signalübertragungswege, in die derartige Faktoren involviert sind, sollen dann gezielt moduliert und die Effekte auf die Entstehung und Eigenschaften hES-Zell-abgeleiteter Neurone bestimmt werden.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) hochrangigen Forschungszielen für den wissenschaftlichen Erkenntnisgewinn im Rahmen der Grundlagenforschung.

Hintergrund der hier genehmigten Forschungsarbeiten ist die Tatsache, dass die Identität somatischer Zellen nicht dauerhaft festgelegt ist. Vielmehr kann sie, beispielsweise durch die forcierte Expression der Gene für bestimmte Transkriptionsfaktoren, verändert werden, wie durch umfangreiche Studien zur Transdifferenzierung somatischer Zellen vielfach belegt wurde. Zudem haben sich Hinweise darauf ergeben, dass die Aufrechterhaltung der Identität terminal differenzierter Zellen offenbar auch eine dauerhafte Repression alternativer Differenzierungs- und Entwicklungsprogramme erfordert und dass an dieser Repression spezifische Transkriptionsfaktoren beteiligt sind, deren funktionale Deletion mit Erkrankungen assoziiert sein kann. Ein solcher Transkriptionsfaktor ist Myt1L, der in terminal differenzierten Neuronen der Maus, nicht aber in anderen murinen Zellen, nachweisbar ist. Myt1L wirkt in Neuronen der Maus als Repressor und hemmt die Entwicklung in Richtung anderer Zelltypen als Neuronen, wie beispielsweise Fibroblasten und Muskelzellen. Ein Indiz dafür, dass MYT1L für die neuronale Entwicklung und für die Identität neuronaler Zellen auch beim Menschen erheblich ist, ist die Assoziation von Veränderungen im MYT1L-Gen mit neurologischen Entwicklungsstörungen und psychischen Erkrankungen, aber auch mit Hirntumoren.

Ziel der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Erlangung eines besseren Verständnisses darüber, auf welchem Wege MYT1L und verwandte Faktoren neuronale Differenzierungsvorgänge beim Menschen steuern und zur Erhaltung der Zellidentität menschlicher Neurone beitragen. Hierfür sollen die Gene für MYT1L und verwandte Faktoren in hES-Zellen funktional deletiert, die entsprechend genetisch veränderten Zellen in Neurone bzw. zerebrale Organoide differenziert und die Effekte auf die Eigenschaften der differenzierten Zellen bestimmt werden. Dies kann Aufschluss darüber erbringen, ob und inwieweit eine funktionale Deletion von MYT1L zu Entwicklungs- und Differenzierungsdefiziten in Neuronen und damit zu einer Veränderung der Identität neuronaler Zellen führt. Zudem werden im Ergebnis der Arbeiten neue humane In-Vitro-Modelle zur Verfügung stehen, an dem die Konsequenzen einer MYT1L-Defizienz in menschlichen Neuronen untersucht und Möglichkeiten einer Reaktivierung von MYT1L studiert werden können.

Ferner sollen die molekularen Grundlagen entschlüsselt werden, auf deren Basis MYT1L seine Funktion in neuronalen Zellen ausübt. Dabei sollen die Zielgene der MYT1L-vermittelten Expressionsrepression bestimmt, physische Wechselwirkungspartner von MYT1L identifiziert und Veränderungen im Epigenom der neuronalen Zellen infolge der MYT1L-Deletion ermittelt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeiten sollen Auskunft darüber erbringen, welche Proteine und Signalwege die reprimierende Wirkung von MYT1L in der Zelle vermitteln und ob (und wenn ja welche) Unterschiede zu murinen Neuronen bestehen. Durch die geplante Identifizierung von Ko-Faktoren, mit denen MYT1L interagiert, und durch die Bestimmung von deren Relevanz für die Induktion und Erhaltung der neuronalen Zellidentität im Menschen werden sich voraussichtlich neue Kenntnisse über die molekularen Grundlagen dieser Prozesse sowie darüber ergeben, welche Signalübertragungswege hierbei eine Rolle spielen. Zudem können die genehmigten Arbeiten dazu beitragen, die Mechanismen der Modulation des Epigenoms durch MYT1L zu verstehen, beispielsweise durch die Identifizierung möglicher direkter Wechselwirkungen von MYTL1 mit Histon-modifizierenden Enzymen.

Insgesamt können die genehmigten Forschungsarbeiten zu einem besseren Verständnis der Funktion und Wirkungsweise des Transkriptionsrepressors MYT1L in menschlichen Neuronen führen. Sie können voraussichtlich zur Beantwortung der Frage danach beitragen, ob es sich bei MYT1L um einen zentralen Repressor alternativer Differenzierungsprozesse auch in Nervenzellen des Menschen handelt. Die Arbeiten können ggf. auch zur Identifizierung von Prozessen führen, deren veränderte Regulation eine Rolle bei der Pathogenese von Erkrankungen wie Autismus und Schizophrenie, aber auch bei der Entstehung von Hirntumoren, spielen, wodurch sich ein besseres Verständnis als bislang über molekulare Ursachen dieser Erkrankungen ergeben kann.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten hinreichend vorgeklärt ist.

Der Genehmigungsinhaber selbst hat umfangreiche Untersuchungen an Neuronen der Maus vorgenommen, durch die die im Forschungsvorhaben zu klärende Fragestellung umfassend vorgeklärt ist. Dabei wurde u. a. gezeigt, dass murines Myt1l andere als neuronale Entwicklungsprogramme unterdrückt (z. B. in Richtung von Fibroblasten (Ektoderm), Hepatozyten (Entoderm) oder Skelettmuskelzellen (Mesoderm) und die die neurale Differenzierung induziert und fördert, indem es die Expression der Gene für bzw. die Aktivität von Transkriptionsfaktoren hemmt, die ihrerseits neurale Differenzierung inhibieren. Ferner wurde gezeigt, dass murines Myt1l mit dem Kofaktor SIN3B interagiert, der in einer Vielzahl inhibitorischer Transkriptionskomplexe präsent ist und zur Remodellierung des Epigenoms beiträgt. Zudem ist murines Myt1l offenbar für die physiologische Funktion bestimmter Nervenzellen essentiell. so wiesen beispielsweise primäre hippokampale Neurone der Maus, in denen die Myt1l-Expression mittels shRNA ausgeschaltet wurde, verminderte Aktionspotentiale auf. RNA-Seq-Analysen zeigten überdies, dass nach funktionaler Ausschaltung von Myt1l die Expression von Genen verstärkt war, deren Produkte andere als neurale Differenzierungsvorgänge anstoßen oder fördern. Die Tatsache, dass beim Menschen ein funktionaler Verlust von MYT1L mit neurologischen Entwicklungsstörungen und psychischen Erkrankungen assoziiert sein kann, ist ebenfalls belegt. So besteht beispielsweise ein Zusammenhang zwischen dem Verlust von MYT1L und pathologischen Entwicklungsverzögerungen, geistiger Retardierung, Schizophrenie und entartetem Zellwachstum. Die geplanten Vorgehensweisen zur Differenzierung von hES-Zellen in Nervenzellen, zur Herstellung von dreidimensionalen zerebralen Organoiden, zur genetischen Veränderung von hES-Zellen sowie zur Analyse des Transkriptoms, Epigenoms, der neuronalen Aktivität und der neuronalen Morphologie sind in der wissenschaftlichen Literatur vielfach beschrieben worden und gut etabliert.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Die beantragten Forschungsarbeiten zielen auf die Aufklärung der Rolle von MYT1L für die Induktion und Erhaltung der neuronalen Zellidentität in menschlichen Neuronen. Grundsätzliche Fragen zur molekularen Funktion von Myt1l wurden bereits im Maussystem geklärt. Aufgrund der speziesspezifischen Unterschiede in der Gehirnentwicklung und in den Eigenschaften des Zentralnervensystems, die zwischen dem Menschen und anderen Spezies bestehen, können in Tieren gewonnene Daten jedoch nicht ohne weiteres auf den Menschen übertragen werden. Zur Gewinnung entsprechender Erkenntnisse für den Menschen werden vielmehr menschliche Zellen benötigt. Die Erreichung der Forschungsziele verlangt zudem die Nutzung humaner pluripotenter Stammzellen, da sich Neurone in für das Forschungsvorhaben erforderlichen Mengen aus anderen menschlichen Zellen, beispielsweise aus Autopsiematerial oder aus neuralen Stammzellen aus abgetriebenen Föten, nicht in reproduzierbarer Qualität gewinnen lassen. Solche Zellen sind außerdem den hier geplanten komplexen genetischen Veränderungen ggf. nicht oder in nicht ausreichendem Maße zugänglich. Die oben genannten sowie andere nicht-pluripotente humane Zellen haben weiterhin bestimmte Stadien der neuralen Entwicklung bereits durchlaufen, die im Forschungsvorhaben bezüglich der Rolle von MYT1L untersucht werden sollen. Ferner gibt es derzeit keine Anhaltspunkte dafür, dass andere als pluripotente Stammzellen erfolgreich für die im Forschungsvorhaben vorgesehene Herstellung von neuronalen Organoiden genutzt werden könnten.

Nach derzeitigem Kenntnisstand können die Forschungsziele auch nicht unter Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) erreicht werden. Da epigenetische Prozesse offenbar von entscheidender Bedeutung für die durch MYT1L verursachten Effekte sind, werden Zellen benötigt, die ein möglichst ursprüngliches Epigenom aufweisen. Dies sind nach gegenwärtigem Kenntnisstand hES-Zellen: zwischen hiPS- und hES-Zellen bestehen teils erhebliche Unterschiede im Epigenom, und verschiedene hiPS-Zell-Linien können sich, beispielsweise aufgrund von Unterschieden im Ausgansmaterial für die Reprogrammierung oder in der Reprogrammierungsmethode, in ihren epigenetischen Eigenschaften maßgeblich unterscheiden. Zudem können hiPS-Zellen ggf. Mutationen enthalten, die bereits in den für die Reprogrammierung genutzten somatischen Zellen präsent sind oder während der Reprogrammierung auftreten. Potentielle Effekte solcher Mutationen auf die Eigenschaften der hiPS-Zellen sowie der aus ihnen differenzierten Neurone können i. allg. aber nicht vorhergesagt werden.

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