155. Genehmigung nach dem Stammzellgesetz

1. Genehmigungsinhaber(in)

Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin

2. Zell-Linien

Die genehmigten Forschungsarbeiten erfolgen unter Verwendung der folgenden humanen embryonalen Stammzell-Linien:

• H1 (WiCell Research Institute, Madison, WI, USA)

Die Genehmigung gilt jeweils auch für Sub-Linien (z.B. für klonale Sub-Linien oder genetisch modifizierte Derivate) der genannten humanen embryonalen Stammzell-Linien.

3. Angaben zum Forschungsvorhaben

Gegenstand der genehmigten Forschungsarbeiten ist die Klärung der Frage, ob und auf welchem Wege eine spezifische Mutation im KCNQ1-Gen-Lokus des Menschen die physiologischen Funktionen von aus genetisch entsprechend veränderten pluripotenten Stammzellen gewonnenen pankreatischen Beta-Zellen beeinträchtigen. Hintergrund dieser Forschungsfrage ist die Identifizierung eines Patienten mit neonatalem Diabetes mellitus, der eine spezifische und bislang nicht charakterisierte Mutation im KCNQ1-Gen aufweist. Von dieser Mutation wird angenommen, dass sie zu einem Verlust der Fähigkeit von KCNQ1 führt, mit anderen Proteinen zu interagieren, wodurch die Fähigkeit zur Bildung funktionaler Kaliumkanäle (sog. KNNQ1/KCNE1-Kanäle) beeinträchtigt und in der Folge die glukoseabhängige Insulinsekretion vermindert wird. Die entsprechende Mutation im KCNQ1-Gen soll daher in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) etabliert, die genetisch veränderten Zellen sollen in Richtung pankreatischer Beta-Zellen differenziert werden und deren Eigenschaften sollen umfassend untersucht werden. Dabei soll insbesondere überprüft werden, ob und inwieweit die aus den mutierten hES-Zellen abgeleiteten Beta-Zellen Veränderungen in der Funktion ATP-abhängiger Kaliumkanäle aufweisen.

4. Hochrangigkeit der Forschungsziele

Die genehmigten Forschungsarbeiten unter Verwendung von hES-Zellen dienen nach übereinstimmender Auffassung der Zentralen Ethik-Kommission für Stammzellenforschung (ZES) und des Robert Koch-Institutes (RKI) der Erreichung hochrangiger Forschungsziele im Rahmen der Grundlagenforschung.

Ziel der beantragten Forschungsarbeiten ist die Beantwortung der Frage, ob und inwieweit eine spezifische Mutation im KCNQ1-Gen zu einer verminderten Beta-Zell-Entwicklung und in der Folge zur Ausbildung eines neonatalen Diabetes mellitus beitragen kann. Dabei soll insbesondere geklärt werden, ob und wenn ja welche Veränderungen bei der Differenzierung auftreten und welche funktionalen Defizite die aus entsprechend mutierten hES-Zellen abgeleiteten (reifen) Beta-Zellen im Vergleich zu genetisch unveränderten Zellen aufweisen.

Das KCNQ1-Gen kodiert für ein Protein, das an der Ausbildung von Kaliumkanälen beteiligt ist, die von zentraler Bedeutung für die induzierbare und physiologische Insulinausschüttung sind. Mutationen im KCNQ1-Gen sind bislang vor allem mit kardialen Erkrankungen assoziiert, insbesondere mit dem sog. Long-QT-Syndrom (LQTS). Darüber hinaus wurde kürzlich die Assoziation einer Mutation im KCNQ1-Gen mit einem schweren neonatalen Diabetes mellitus gefunden. Die Frage danach, warum diese Mutation im KCNQ1-Gen auch eine schwere Hypoinsulinämie in Neugeborenen auslösen kann, ist derzeit offen. Im Rahmen der genehmigten Forschungsarbeiten sollen hES-Zellen daher mit einer entsprechenden Mutation versehen, in pankreatische Beta-Zellen differenziert und zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung bezüglich ihrer molekularen und physiologischen Eigenschaften analysiert werden, insbesondere hinsichtlich der Differenzierungseffizienz, der Präsenz von Insulin-Granula und des zytosolischen Kalziumgehaltes. Ferner soll analysiert werden, ob die Kaliumkanäle, an deren Bildung KCNQ1 beteiligt ist, in den genetisch veränderten Zellen andere elektrische Eigenschaften aufweisen als im Wildtyp-Zustand. Die Untersuchungen sollen Aufschluss über potentielle, durch die Mutation bedingte Differenzierungsdefizite und funktionale Veränderungen geben, was voraussichtlich auch neue Erkenntnisse über die Rolle eines integren KCNQ1-Genprodukts im pankreatischen Differenzierungsprozess erbringen kann. Dies kann ggf. von Bedeutung für ein verbessertes Verständnis von den molekularen Grundlagen der pankreatischen Differenzierung beim Menschen sein.

Da die Mutation im KCNQ1-Gen zu Veränderungen in der Struktur einer Protein-Domäne führt, die in die Interaktion des Kanalproteins KCNQ1 mit für die Kanalfunktion wesentlichen Proteinen und Kofaktoren involviert ist, könnte die verminderte Bindung dieser Proteine/Kofaktoren an KCNQ1 Ursache für die fehlende bzw. verminderte Funktion des Kalium-Kanals und damit für eine inadäquate Ausschüttung von Insulin sein. Daher sollen die Wechselwirkungen von KCNQ1 mit seinen Bindungspartnern in aus mutierten hES-Zellen abgeleiteten Beta-Zellen quantifiziert und auf diesem Wege die mögliche Ursache der physiologischen Fehlfunktion geklärt werden. Daraus könnten sich Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen der Mutation und der veränderten Funktion des KCNQ1-Proteins, einer ggf. verminderten Differenzierung zu Beta-Zellen sowie den veränderten Eigenschaften der Beta-Zellen ergeben.

Das Forschungsvorhaben zielt insgesamt auf die Gewinnung eines Erkenntnisgewinns über die molekularen und zellulären Ursachen eines spezifischen Falls von neonatalem Diabetes mellitus. Die Forschungsarbeiten können darüber hinaus ggf. auch zu einem besseren Verständnis von der Rolle von KCNQ1 bei der Pankreasentwicklung beim Menschen beitragen.

5. Notwendige Vorarbeiten und Erforderlichkeit der Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen für die mit dem Vorhaben verfolgten Fragestellungen

Im Antragsverfahren wurde dargelegt, dass das Projekt in allen wesentlichen Punkten hinreichend vorgeklärt ist.

Eine Assoziation von Diabetes Typ 2 mit SNPs (Single Nucleotid Polymorphisms) im KCNQ1-Gen wurde bereits in der Vergangenheit festgestellt, die genaue molekulare Ursache ist bislang nicht geklärt. Allerdings gibt es in der Literatur Anhaltspunkte dafür, dass in der Maus die Beta-Zellmasse durch den Kcnq1-Lokus reguliert wird. Der Patient mit der hier vorliegenden homozygoten Mutation im KCNQ1-Gen wurde im Rahmen eines genetischen Screenings identifiziert, die Auswirkungen der Mutation wurden bereits beschrieben. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Effekte dieser Mutation wurde ein entsprechend mutiertes humanes KCNQ1-Gen in eine murine Beta-Zell-Linie verbracht. Dabei wurde festgestellt, dass die Mutation zu einer Verminderung der Insulinproduktion und Insulinsekretion führte.

Daten aus Vorarbeiten zeigen eine Veränderung der physiologischen Eigenschaften von Zellen mit der betreffenden Mutation im KCNQ1-Gen. So zeigten KCNQ1-defiziente CHO-Zellen nach Transfektion mit mutierten KCNQ1-Gen-Konstrukten im Patch-Clamp veränderte elektrische Eigenschaften, und ein funktionaler knock out von KCNQ1 geht in Mäusen mit einer deutlichen Verminderung der Beta-Zell-Masse einher. Zudem wurden aus Blutzellen des Patienten mit der betreffenden Mutation im KCNQ1-Gen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS-Zellen) hergestellt. In diesen Zellen konnte der KCNQ1^mut-Phänotyp mittels Gene Editing in den Wildtyp-Zustand zurückgeführt werden, so dass umgekehrt davon ausgegangen werden kann, dass eine entsprechende Mutation in hES-Zellen erzeugt werden kann. Eine effiziente pankreatische In-vitro-Differenzierung konnte jedoch weder für die patientenspezifischen hiPS-Zellen noch für die genetisch korrigierten Zellen erreicht werden, während die pankreatische Differenzierung der hES-Zell-Linie H1 äußerst effizient ist.

Im Antragsverfahren wurde ferner dargelegt, dass sich der mit dem Forschungsvorhaben angestrebte Erkenntnisgewinn voraussichtlich nur unter Verwendung von hES-Zellen erreichen lässt.

Primäres Ziel der Forschungsarbeiten ist es, die Grundlagen pankreatischer Effekte einer spezifischen Mutation im KCNQ1-Gen des Menschen zu verstehen. Dieses Ziel kann nicht durch Untersuchungen an Zellen anderer Spezies, insbesondere von Nagern, erreicht werden. Nager weisen hinsichtlich der Physiologie und des Stoffwechsels im Vergleich mit dem Menschen erhebliche Unterschiede auf. Während beispielsweise eine Punktmutation im Kcnj11-Gen, das für eine Untereinheit eines ATP-abhängigen Kaliumkanals kodiert, in der Maus keine phänotypische Auswirkung hat, ist die identische Mutation beim Menschen mit Hyperinsulinämie assoziiert. Die Forschungsziele können auch nicht durch Nutzung anderer als humaner pluripotenter Stammzellen erreicht werden, da die Effekte der KCNQ1-Gen-Muation auf die pankreatische Differenzierung und auf die (Vorläufer)Zellen untersucht werden sollen, die in verschiedenen Differenzierungsstadien auftreten. Andere humane Zellen (beispielsweise somatische (Stamm)Zellen, fötale Zellen etc.) haben die hier interessierenden Differenzierungsschritte aber entweder bereits durchlaufen oder sie verfügen nach derzeitigem Kenntnisstand nicht über das erforderliche Differenzierungspotential. Hinweise darauf, dass adulte pankreatische Stammzellen des Menschen in Kultur vermehrt und zu Beta-Zellen differenziert werden könnten, liegen weiterhin nicht vor.

Die Forschungsziele können nach derzeitigem Kenntnisstand voraussichtlich auch nicht unter Nutzung von hiPS-Zellen erreicht werden. Zwar wurden auch hiPS-Zellen bereits zur Herstellung pankreatischer Beta-Zellen eingesetzt, jedoch haben hiPS-Zellen ein stark variierendes und deutlich geringeres pankreatisches Differenzierungspotential als hES-Zellen. Es ist nicht geklärt, welche Konsequenzen die häufig beobachteten, infolge der Reprogrammierung auftretenden genetischen Veränderungen und das für hiPS-Zellen postulierte epigenetische Gedächtnis für das pankreatische Differenzierungspotential von hiPS-Zellen haben. Hier ist aber ein Material erforderlich, in dem sich der Effekt einer einzigen, spezifischen Mutation vor einem sonst nach Möglichkeit ursprünglichen genetischen Hintergrund analysieren lässt. Die Frage danach, in welchem Umfang der Reprogrammierungsprozess zu genetischen Veränderungen führt, ist weiterhin strittig. In Studien, in denen sowohl hES- als auch hiPS-Zellen in funktionale Beta-Zellen differenziert wurden, wurde zudem eine geringere Effizienz der pankreatischen Differenzierung von hiPS-Zellen festgestellt. Auch Vorarbeiten beim Antragsteller haben gezeigt, dass sich hiPS-Zellen nicht effizient und reproduzierbar zu funktionalen Beta-Zellen differenzieren ließen.

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